一种高效薄层色谱联用明亮发光杆菌生物传感快速定量筛检水果中克菌丹残留的方法与流程

本发明涉及一种高效薄层色谱联用明亮发光杆菌生物传感快速定量筛检水果中克菌丹残留的方法，属于食品检测技术领域。

背景技术：

克菌丹（n-(trichloromethylthio)-4-cyclohexene-1,2-dicarboximide），属于有机硫类物质，是农业生产中最广泛应用于植物保护目的的广谱杀真菌剂之一。特别是对于收获后的各种水果和蔬菜，克菌丹具有良好的保鲜性能，可以保证水果储藏加工后仍然具有新鲜和健康的外观。尽管如此，人们已经注意到滥用克菌丹会存在潜在威胁公共健康的可能性。近期研究证明，除了呕吐和结膜炎等急性中毒症状外，即使在低剂量水平的克菌丹暴露也可能导致对人类生殖系统的损害。因此，对水果和蔬菜中的克菌丹进行快速，简单和可靠的筛查对公共食品安全至关重要。所以，建立一种快速而可靠的分析方法用于快速筛检水果食品中克菌丹的残留具有极其重要的意义。

然而，值得注意的是，克菌丹分子的特点给常规分析方法带来了极大的困难。具体来说，克菌丹分子不仅在电喷雾条件下很难电离，并且在高温下非常不稳定，极易分解。由于这些限制，克菌丹实际上既不适合于hplc-ms分析，也不适合gc分析，尽管它们是用于确认和定量食品中有害残留物的使用最广泛的工具。除此之外，还需要特别注意的是克菌丹分子稳定性对ph条件也非常敏感，在样品制备和清理过程中必须避免ph波动引起的克菌丹降解。例如，通常用伯-仲胺试剂作为固相萃取吸附剂对食品样品进行清理是进行柱色谱分析之前必须进行的步骤。然而这一试剂的加入可能造成萃取溶液ph升至中性或弱碱性条件（ph=7-9），最终导致克菌丹分解，得到假阴性结果。由此可见，上述问题的存在使得传统的柱色谱方法难以实现克菌丹的准确分析。

技术实现要素：

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种高效薄层色谱联用明亮发光杆菌生物传感快速定量筛检水果中克菌丹残留的方法。

本发明的技术方案，高效薄层色谱联用明亮发光杆菌生物传感快速定量筛检水果中克菌丹残留的方法，将待测水果样品通过简单的a-quechers萃取步骤进行制备，然后将萃取液在薄层板上展开，再通过浸渍的方式将明亮发光杆菌悬浮液与色谱分离结果耦合，使用生物发光成像仪记录目标物对细菌生物发光的抑制作用，并借助数字图像软件分析对检测结果进行定量分析。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将待测样品在薄层板上展开，再通过浸渍的方式将明亮发光杆菌悬浮液与色谱分离结果耦合，使用生物发光成像仪记录目标物对细菌生物发光的抑制作用，并借助数字图像软件分析对检测结果进行定量分析。

在本发明的一种实施方式中，所述展开使用流动相是甲苯：乙酸乙酯=8：2（v/v）。

在本发明的一种实施方式中，所述生物发光自显影检测是在高效薄层色谱上基于明亮发光杆菌生物传感的检测，明亮发光杆菌悬浮液是浸渍耦合所需的液体，发光菌液需要在25℃和100r/min条件下的摇床中培养36h，之后用于已展开薄层板的浸渍耦合。

在本发明的一种实施方式中，所述待测样品先在薄层色谱上展开，使得目标物与水果中的干扰基质物质实现分离，提高后续检测的选择性。

所述生物发光成像仪是在可视化条件下，检测区域是色谱分离后的目标物在窗口区域干扰细菌生理代谢进而造成生物发光抑制形成黑斑，为肉眼检视提供便利，之后使用基于数字化图像像素模拟扫描的分析可以实现对成像结果的定量分析。

其在本发明的一种实施方式中，将待测样品通过高效薄层色谱展开，使目标物克菌丹与萃取液中的样品干扰基质物质分离，再通过浸渍的方式将色谱分离结果与明亮发光杆菌生物传感相耦合，通过生物发光成像结合数字图像分析定量评估水果中目标物克菌丹残留浓度。

在本发明的一种实施方式中，所述待测水果样品包括苹果、梨和樱桃。

在本发明的一种实施方式中，所述制样和样品清理：将10g水果样品的匀浆加入45-55ml离心管，继续加入8-12ml乙腈，0.1ml甲酸，振荡混匀，超声水浴8-12min；再加入4g无水硫酸镁和1g无水醋酸钠，振荡混匀，3500-4500r/min离心4-6min，取上层乙腈相2-4ml，过0.45μm滤膜，即得到可以直接用于分析的液体样品。

在本发明的一种实施方式中，所述薄层色谱的展开为：将1-10μl用于分析的液体样品点样，点样后用甲苯：乙酸乙酯=8：2（v/v）作为流动相展开，上行展开距离60mm后停止，展开完成后将薄层板置于100℃平板加热器上充分干燥5min。

在本发明的一种实施方式中，经展开并干燥后的薄层板进行生物发光自显影检测，之后通过生物发光成像装置记录检测结果，可以通过肉眼检视得到非常直观的半定量结果。

在本发明的一种实施方式中，通过videoscan软件对获得的数字化图像进行模拟扫描，可以实现检测结果的准确定量分析。

在本发明的一种实施方式中，将经过色谱展开和生物发光自显影后所得的薄层板置于生物发光成像仪拍照，并结合数字化图像软件定量分析，通过绘制标准曲线，计算水果样品中目标物克菌丹的含量。根据扫描定量所得检测结果得到标准曲线：y=163.46x+1336.1，计算水果样品中克菌丹的含量；其中，y为色谱峰面积，单位au；x为克菌丹含量，单位ng。

本发明的有益效果：本发明建立了一种高效薄层色谱-生物发光自显影联用快速定量筛检水果中克菌丹残留的方法，单次运行同时检测多种样品，实现了高通量筛检的要求。检测限可达到0.5~1mg/kg，检测方法可实现重复性rsd<3.4%，加标回收率在78.4%-97.7%，此方法具有快速、准确、经济的优点；同时基于高效薄层色谱和生物发光自显影联用检测方法的建立为食品中光谱特征不明显的有害物质残留的快速可靠筛检提供了方法范例。

附图说明

图1为实施例1克菌丹标准溶液展开图与线性关系。

图2-a为基质效应展开图，黑白背景。

图2-b为基质效应扫描图，彩色背景。

图3为实施例3加标回收率展开图。

1、苹果；2、梨；3、克菌丹标准溶液；4、樱桃。

具体实施方式

实施例1

（1）克菌丹标准液的制备：用乙酸乙酯为溶剂，制备浓度为0.01mg/ml的克菌丹的标准溶液，之后建立标准曲线需将标准液进行稀释至0.001和0.0005mg/ml；

（2）高效薄层色谱分离：将4-8μl克菌丹的标准品、苹果、梨和樱桃样品用linomat5进行精确点样，点样完成后用展开液（甲苯：乙酸乙酯=8：2（v/v））展开，上行展开距离60mm，展开完成后取出硅胶板置于100℃平板加热器上充分干燥5min；

（3）生物发光成像仪成像：将步骤（2）高效薄层色谱板通过浸渍的方式将明亮发光杆菌悬浮液与色谱分离结果耦合，之后置于生物发光成像仪中进行成像；

（4）数字化图像软件定量分析：将经过色谱展开和生物发光自显影后所得的薄层板置于生物发光成像仪拍照后，结合数字化图像软件定量分析。扫描结束后，以扫描色谱峰面积为y轴，克菌丹含量为x轴，制作标准曲线。

克菌丹标准溶液展开图与线性关系如图1所示，基质效应展开图2-a所示，基质效应扫描图如图2-b所示。通过标准曲线计算样品中克菌丹的含量。

实施例2

具体实施方式同实施例1，区别在于，展开流动相的选取，经试验甲苯：乙酸乙酯=8：2（v/v）展开效果最佳，之后进行基质效应实验，使用同样比例流动相进行展开，展开效果无明显区别，说明样品基质对展开无明显干扰，之后加标回收率展开均用此流动相。

实施例3

（1）分别对苹果、梨和樱桃以及不同的加标量进行检测。

分别对水果：苹果、梨和樱桃的预处理：将10g水果样品的匀浆加入50ml离心管，继续加入10ml乙腈，0.1ml甲酸，振荡混匀，超声水浴10min；再加入4g无水硫酸镁和1g无水醋酸钠，振荡混匀，4000r/min离心5min，取上层乙腈相2-4ml，过0.45μm滤膜，即可得到可以直接用于分析的液体样品，将其在4℃中冷藏。

加标回收率样液的预处理：将10g水果样品的匀浆加入50ml离心管，继续加入10ml乙腈，0.1ml甲酸，振荡混匀，超声水浴10min；再加入4g无水硫酸镁和1g无水醋酸钠，振荡混匀，4000r/min离心5min，取上层乙腈相2-4ml，过0.45μm滤膜，即可得到可以直接用于分析的液体样品。苹果萃取液中加入15μl0.01mg/ml的克菌丹，梨萃取液中加入10μl0.01mg/ml的克菌丹和樱桃萃取液中加入10μl0.01mg/ml的克菌丹，将其在4℃中冷藏。

（2）采用0.5mpa氮气为载体，用100μl注射器(camag)将样品和克菌丹标准品用linomat5进行精确点样于20×10cm的薄层板上，点样的条带长6mm，条带距离底部8mm，距离左端12mm，条带间距1.7mm。点样完成后用adc-2(camag)展开仪展开，展开前，通过在另一槽注入10ml的流动相使缸内达到饱和状态。取10ml优化后的展开液（甲苯：乙酸乙酯=8：2（v/v）），上行展开60mm取出，置于100℃平板加热器上充分干燥5min。随后通过浸渍的方式将明亮发光杆菌悬浮液与色谱分离结果耦合。

之后将其置于生物发光成像仪上，在40秒曝光条件下获取硅胶板的图像，随后在电脑上使用数字化图像软件进行定量分析。人工添加不同含量的克菌丹均能够获得清晰的成像，图3结果显示，根据1-4的检测结果可计算不同样品克菌丹回收率的标准曲线，将苹果、梨和樱桃的色谱峰值代入标准曲线，经计算，苹果中克菌丹含量为734.22ng，梨中克菌丹含量为455.21ng，樱桃中克菌丹含量分为461.23ng，苹果中克菌丹加标回收率为97%，梨中克菌丹的加标回收率为91%，樱桃中克菌丹的加标回收率为92.2%，与hplc检测结果基本一致。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。