肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法与流程

本发明涉及体外诊断试剂
技术领域：
，尤其涉及一种肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法。
背景技术：
：抹香鲸肌红蛋白三级结构于1960年由kendrew用x线衍射法阐明，这是世界上第一个被描述的蛋白质三级结构。肌红蛋白(myo)是一种细胞内结合氧血红素蛋白，普遍存在于心肌和骨骼肌中，分子量为17,800道尔顿。在急性心肌损伤时，myo最先被释放入血液中，在症状出现约2-3小时后，血中myo可超出正常上限，9-12小时达到峰值，24-36小时后恢复正常。因此，测定血清或血浆肌红蛋白可作为急性心肌梗死(ami)诊断的早期最灵敏的指标，具有良好的临床诊断价值，可用于评估潜在的急性心肌梗塞病症，并辅助诊断急性心肌梗塞，还可用于再梗死的诊断，结合临床，如myo重新升高，应考虑为再梗死或者梗死延展。目前用于检测肌红蛋白的免疫分析方法主要有酶联免疫分析法(elisa法)和化学发光免疫分析法。酶联免疫分析法采用辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶标记抗体，用于催化发光底物产生颜色变化，具有操作简单，试剂稳定性长等特点，但是标记物易失活，发光底物需要避光，试剂的检测灵敏度较低，导致测试结果不准确。化学发光免疫分析法采用催化剂催化化学发光物质形成一种激发态中间体，当激发态中间体回到稳定的基态时，发出光子，具有操作简单，自动化程度高，检测速度快等优点。目前市售的肌红蛋白检测试剂盒主要分为以下2种：一是elisa方法即辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶标记一株肌红蛋白抗体，固相载体(微孔板或固相微粒)包被另一株肌红蛋白抗体，利用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶催化发光底物产生颜色变化，检测血清或血浆中肌红蛋白的浓度；二是三联吡啶钌电化学发光法，采用链霉亲和素磁珠，一株肌红蛋白抗体标记生物素，另一株肌红蛋白抗体标记三联吡啶钌，经过免疫反应形成磁珠-链霉亲和素-生物素-肌红蛋白抗体-肌红蛋白-肌红蛋白抗体-三联吡啶钌复合物，在电场加压条件下发光。以上定量检测肌红蛋白的方法存在一下缺陷：1)elisa方法采用微孔板作为固定性，包被密度有限，灵敏度较低，反应时间较长；2)采用三联吡啶钌的电化学发光法，仪器要求较高，试剂及仪器昂贵。技术实现要素：本发明针对上述技术问题，提供一种肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，具有检测灵敏度高，特异性好，操作简单等优点。为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，包括以下试剂：r1：含有链霉亲和素包被的磁微粒的缓冲液；r2：含有化学发光标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的缓冲液；r3：含有偶联标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的缓冲液；其中，r1中链霉亲和素磁颗粒质量百分比为0.02％～1％；链霉亲和素包被的磁微粒的粒径是0.05～3μm，浓度为10mg/ml；r2中肌红蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:1-1:20；化学发光标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的浓度为≥0.2μg/ml。r3中肌红蛋白单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比为1:1-1:20；偶联标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的浓度为≥0.7μg/ml；优选的技术方案中，上述的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，包括以下试剂：r1：含有链霉亲和素包被的磁微粒的缓冲液；r2：含有化学发光标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的缓冲液；r3：含有偶联标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的缓冲液；其中，r1中链霉亲和素磁颗粒质量百分比为0.072％；链霉亲和素包被的磁微粒的粒径是3μm，浓度为10mg/ml；r2中肌红蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:3；化学发光标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的浓度为0.4μg/ml。r3中肌红蛋白单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比为1:5；偶联标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的浓度为1.4μg/ml；优选的技术方案中，上述的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，r1的制备方法为：取磁微粒，用20mmpb缓冲液清洗3次，然后稀释至10mg/ml，按照磁微粒与链霉亲和素所述的质量比添加链霉亲和素，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mmpb缓冲液清洗3次，加入封闭液，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mmpb缓冲液清洗3次，用20mmpb缓冲液稀释至10mg/ml，2-8℃保存备用，得到含有链霉亲和素包被的磁微粒的液体试剂；所述封闭液为含2～5％bsa的20mmpb缓冲液。优选的技术方案中，上述的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，r2的制备方法为：取肌红蛋白单克隆抗体，用20mmpb缓冲液置换肌红蛋白单克隆抗体保存液，用20mmpb缓冲液稀释至1mg/ml，按照抗体与偶联标记物的摩尔比进行添加偶联标记物，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，37℃孵育2-4h，最后对蛋白进行纯化，得到含有偶联标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的液体试剂；所述封闭液为含2～5％bsa的20mmpb缓冲液。优选的技术方案中，上述的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，r3的制备方法为：取肌红蛋白单克隆抗体，用20mmpb缓冲液置换肌红蛋白单克隆抗体保存液，用20mmpb缓冲液稀释至1mg/ml，按照抗体与化学发光标记物的摩尔比添加化学发光标记物，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，37℃孵育2-4h，最后对蛋白进行纯化，得到含有化学发光标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的液体试剂；所述封闭液为含2～5％bsa的20mmpb缓冲液。优选的技术方案中，上述的化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或三联吡啶钌，优选为吖啶酯。优选的技术方案中，上述的偶联标记物为生物素。优选的技术方案中，上述的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，还包括七个浓度的校准品和两个浓度的质控品，校准品中含有肌红蛋白的浓度分别为0ng/ml、10±1ng/ml、50±5ng/ml、100±10ng/ml、300±30ng/ml、600±60ng/ml及1200±120ng/ml；高浓度质控品中含有铁蛋白的浓度为650±65ng/ml，低浓度质控品中含有铁蛋白的浓度为160±16ng/ml，校准品或质控品的缓冲液为含有0.1mol/l的pb、0.15mol/l的氯化钠、1％的牛血清白蛋白及0.05％tween-20、ph值为6.5的缓冲液。上述的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，还包括清洗缓冲液、酸性激发液和碱性激发液。其中，清洗缓冲液包括50g/l磷酸氢二钠、10g/l磷酸二氢钠、100g/lnacl、2％的triton-100和2％的proclin-300；酸性激发液为过氧化氢和硝酸水溶液，过氧化氢的质量浓度为1～2％，硝酸的摩尔浓度为6～8mm；碱性激发液为氢氧化钠水溶液，氢氧化钠的摩尔浓度为0.3～0.4m。本发明还提供了上述的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：s1、制备试剂r1，r1的制备方法为：取磁微粒，用20mmpb缓冲液清洗3次，然后稀释至10mg/ml，按照磁微粒与链霉亲和素所述的质量比添加链霉亲和素，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mmpb缓冲液清洗3次，加入封闭液，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mmpb缓冲液清洗3次，用20mmpb缓冲液稀释至10mg/ml，2-8℃保存备用，得到含有链霉亲和素包被的磁微粒的液体试剂；s2、制备试剂r2，r2的制备方法为：取肌红蛋白单克隆抗体，首先用20mmpb缓冲液置换肌红蛋白单克隆抗体保存液，用20mmpb缓冲液稀释至1mg/ml，按照抗体与化学发光标记物摩尔比添加化学发光标记物，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，37℃孵育2-4h，最后对蛋白进行纯化，得到含有化学发光标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的液体试剂；s3、制备试剂r3，r3的制备方法为：取肌红蛋白单克隆抗体，首先用20mmpb缓冲液置换肌红蛋白单克隆抗体保存液，用20mmpb缓冲液稀释至1mg/ml，按照抗体与偶联标记物的摩尔比添加偶联标记物，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，37℃孵育2-4h，最后对蛋白进行纯化，得到含有偶联标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的液体试剂；所述封闭液为含2～5％bsa的20mmpb缓冲液。本发明还提供了上述的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：1)将待测样本与r2及r3试剂孵育10min，样本中肌红蛋白抗原分别与偶联标记物标记的肌红蛋白第一抗体、化学发光标记物标记的肌红蛋白第二抗体发生免疫反应，形成偶联标记物-肌红蛋白抗体-肌红蛋白-肌红蛋白抗体-化学发光标记物溶剂；2)再加入r1试剂孵育10min，链霉亲和素磁珠与偶联标记物结合，形成磁珠-链霉亲和素-偶联标记物-肌红蛋白抗体-肌红蛋白-肌红蛋白抗体-化学发光标记物复合物；3)加入清洗缓冲液洗涤，将未反应的溶液清洗去除；4)加入酸性激发液，使化学发光标记物游离；加入碱性激发液，使化学发光标记物发射光子；光电倍增管接收光量子数与肌红蛋白的含量成正比。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，利用亲和素-偶联标记物体系，以及采用化学发光标记物进行化学发光，大大提高了试剂盒的检测灵敏度，减少反应时间，降低试剂成本，可用于血清/血浆中的肌红蛋白含量的定量检测。本发明提供的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，该方法简单易操作，制备得到的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，灵敏度高、线性范围广、稳定性好。本发明提供的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒的检测方法，采用双抗体夹心法的原理，稳定性好，特异性强，灵敏度高，线性范围广，检测时间短为临床诊断提供更为特异、稳定、快速、可靠的检测手段，解决了现有技术中试剂的有效期短、操作繁琐、灵敏度低、检测成本高的缺点，可定量测定人体血清/血浆中肌红蛋白的含量。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例提供的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒剂量反应校准曲线。具体实施方式本发明提供的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，包括以下试剂：r1：含有链霉亲和素包被的磁微粒的缓冲液；r2：含有化学发光标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的缓冲液；r3：含有偶联标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的缓冲液；其中，r1中链霉亲和素磁颗粒质量百分比为0.02％～1％，优选的为0.072％；链霉亲和素包被的磁微粒的粒径是0.05～3μm，优选的为3μm；r2中肌红蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:1-1:20，优选为1:3；化学发光标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的浓度为≥0.2μg/ml，优选浓度为0.4ug/ml。r3中肌红蛋白单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比为1:1-1:20，优选为1:5；偶联标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的浓度为≥0.7μg/ml，优选浓度为1.4ug/ml；上述的化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或三联吡啶钌，优选为吖啶酯，偶联标记物为生物素。上述的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，还包括七个浓度的校准品和两个浓度的质控品，校准品中含有肌红蛋白的浓度分别为0ng/ml、10±1ng/ml、50±5ng/ml、100±10ng/ml、300±30ng/ml、600±60ng/ml及1200±120ng/ml；高浓度质控品中含有铁蛋白的浓度为650±65ng/ml，低浓度质控品中含有铁蛋白的浓度为160±16ng/ml，校准品或质控品的缓冲液为含有0.1mol/l的pb、0.15mol/l的氯化钠、1％的牛血清白蛋白及0.05％tween-20、ph值为6.5的缓冲液。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图和实施例对本发明作进一步的详细介绍。实施例1肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒的制备1)链霉亲和素包被磁微粒取一定量的磁微粒，用20mmpb缓冲液清洗3次，然后稀释至10mg/ml，按照磁微粒与链霉亲和素质量比0.02％的比例添加链霉亲和素，37℃孵育18h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mmpb缓冲液清洗3次，加入封闭液(含2％bsa的20mmpb缓冲液)，37℃孵育18h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mmpb缓冲液清洗3次，用20mmpb缓冲液稀释至10mg/ml保存备用，得到包被链霉亲和素的磁微粒；2)吖啶酯标记肌红蛋白抗体取一定量的肌红蛋白抗体，用20mmpb缓冲液置换肌红蛋白抗体保存液，然后用20mmpb缓冲液稀释至1mg/ml，按照抗体与吖啶酯摩尔比1：3添加吖啶酯，37℃孵育2h进行标记，然后加入封闭液(含2％bsa的20mmpb缓冲液)，37℃孵育2h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到吖啶酯标记的肌红蛋白抗体。3)生物素标记肌红蛋白抗体取一定量的肌红蛋白抗体，用20mmpb缓冲液置换肌红蛋白抗体保存液，然后用20mmpb缓冲液稀释至1mg/ml，按照抗体与生物素摩尔比1：5添加生物素，37℃孵育2h进行标记，然后加入封闭液(含2％bsa的20mmpb缓冲液)，37℃孵育2h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到生物素标记的肌红蛋白抗体；实施例2肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒的制备1)链霉亲和素包被磁微粒取一定量的磁微粒，用20mmpb缓冲液清洗3次，然后稀释至10mg/ml，按照磁微粒与链霉亲和素质量比1％的比例添加链霉亲和素，37℃孵育24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mmpb缓冲液清洗3次，加入封闭液(含5％bsa的20mmpb缓冲液)，37℃孵育24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mmpb缓冲液清洗3次，用20mmpb缓冲液稀释至10mg/ml保存备用，得到包被链霉亲和素的磁微粒；2)吖啶酯标记肌红蛋白抗体取一定量的肌红蛋白抗体，用20mmpb缓冲液置换肌红蛋白抗体保存液，然后用20mmpb缓冲液稀释至1mg/ml,按照抗体与吖啶酯摩尔比1：20添加吖啶酯，37℃孵育4h进行标记，然后加入封闭液(含5％bsa的20mmpb缓冲液)，37℃孵育4h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到吖啶酯标记的肌红蛋白抗体。3)生物素标记肌红蛋白抗体取一定量的肌红蛋白抗体，用20mmpb缓冲液置换肌红蛋白抗体保存液，然后用20mmpb缓冲液稀释至1mg/ml,按照抗体与生物素摩尔比1：20添加生物素，37℃孵育4h进行标记，然后加入封闭液(含5％bsa的20mmpb缓冲液)，37℃孵育4h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到生物素标记的肌红蛋白抗体；实施例3作为本实施例一种肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒的一个优选方案，r1中所述磁微粒与链霉亲和素质量比0.072％；r2中所述肌红蛋白第二抗体与吖啶酯摩尔比1：3，吖啶酯标记肌红蛋白抗体浓度为0.4ug/ml。r3中所述肌红蛋白第一抗体与生物素摩尔比1：5，生物素标记肌红蛋白抗体浓度为1.4ug/ml；实施例4校准品和质控品的制备①校准品缓冲液的组成：包括0.1mol/l的pb、0.15mol/l的氯化钠、1％的牛血清白蛋白及0.05％的tween-20，ph值6.5，2-8℃存放备用；②取一定量的市售肌红蛋白标准品，用①步所得校准品缓冲液分别配制成理论浓度为0.00ng/ml、10.00ng/ml、50.00ng/ml、100.00ng/ml、300.00ng/ml、600.00ng/ml、1200.00ng/ml的校准品，等量分装。质控品制备方法同上，配制成理论浓度为160.00ng/ml，650.00ng/ml的质控品，等量分装。采用实施例3制备的试剂盒测试7个浓度的校准品，肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒剂量反应校准曲线参见图1所示，线性相关系数r≥0.9900，校准合格，具体相关参数如表1：表1.肌红蛋白测定试剂盒剂量反应校准曲线相关参数校准点校准品浓度(ng/ml)光量10.00632210.003048350.00172414100.00420115300.001993336600.0057920171200.001973416实施例5肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒的性能评估①低检测限检测用实施例4的零浓度校准品或样本稀释液作为样本进行检测，采用实施例3制备的试剂盒重复测定20次，得出20次检测结果的rlu值(相对发光值)，计算其平均值(m)和标准差(sd)，得出m+2sd，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度—rlu值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将m+2sd的rlu值带入上述方程，求出对应的浓度值，即为最低检测限，结果应符合应<3.0ng/ml。结果如表2所示：表2.最低检测限数据②性能检测将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度，其中稀释后的最低值浓度样本须接近线性范围的下限，线性范围为3.0-1200ng/ml。将每一浓度的样本采用实施例3制备的试剂盒重复检测3次，计算平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r，结果应符合线性范围，线性相关系数r应≥0.9900。结果如表2所示：表2.线性检测数据③复性检测用实施例3制备的试剂盒，对高值和低值两个浓度的质控品样本各重复检测10次，计算10次测量结果的平均值和标准差sd，根据公式(1)计算变异系数(cv)，结果应符合变异系数(cv)应≤8.0％。式中：cv—变异系数；sd—测量结果的标准差；—测量结果的平均值。结果如表3所示：表3.重复性数据由检测结果显示本发明所涉及试剂盒检测线性相关系数r≥0.9900，即线性检测合格；最低检测限是＜3.0ng/ml；重复性检测结果符合变异系数(cv)应≤8.0％要求，即重复性检测合格。综上，本试剂盒具有灵敏度高、线性范围广、稳定性好的特点。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，但这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。当前第1页12