一种提取分离植物色素组分的高效液相方法与流程

本发明属于化学成分分离提纯技术领域，具体涉及一种提取分离植物色素组分的高效液相方法。

背景技术：

光合作用，即光能合成作用，是植物、藻类和某些细菌，在可见光的照射下，利用光合色素，将二氧化碳(或硫化氢)和水转化为有机物，并释放出氧气(或氢气)的生化过程.光合作用是一系列复杂的代谢反应的总和，是生物界赖以生存的基础，也是地球碳氧循环的重要媒介。

在光合作用过程中，植物的光合色素对光能进行吸收、运输、及转换为体内的有机物。光合色素存在于叶绿体类囊体膜，包含叶绿素、反应中心色素和辅助色素。几类色素的吸收光谱不同，叶绿素a、b吸收红，橙，蓝，紫光，类胡萝卜素吸收蓝紫光，吸收率最低的为绿光。叶绿体的不同色素在光合作用中的分工不同，所以不同色素的比例关系也会影响光合作用，光合效率及叶片的颜色。对于浮游植物来说，浮游植物色素具有重要的指标作用，例如浮游植物色素中的类胡萝卜素可以作为生物标志物，可以较好的指示浮游生物群落结构。对色素深入研究，可以更好的阐述浮游生物群落变化，深入了解海洋生态环境变化，对于研究整体地球生态圈化学反应循环具有非常重要的意义。

光合色素在生长过程中是处于不断合成和破坏的，每个色素组分的含量是两者动态平衡的表现。所以色素含量在一定程度上能反映植株的的生理生化指标例如：光合强度、营养水平及健康状况等。监测植株叶绿体色素组分的含量，对于研究植株的色素变化规律是十分有必要的，进一步解决人工环境中调控植物生长发育的难题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高效快速分离分析绿色植物色素的液相方法。

为解决上述问题，本发明采用的技术方案为：

一种提取分离植物叶绿体色素的高效液相方法，包括以下步骤：

(1)标准品溶液的配制：取标准品，溶解，制得标准品溶液；

(2)供试品溶液的配制：取新鲜叶片，研磨提取色素，制得供试品溶液；

(3)分别吸取标准品溶液、供试品溶液注入高效液相色谱仪，其色谱条件如下：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：300～600nm；流动相：以甲醇-乙腈-四氢呋喃混合溶液为流动相A，以甲醇-乙酸乙酯混合溶液为流动相B；

其流动相所采用的线性梯度洗脱程序如下：

0～9min，流动相A相所占的体积比为100％，流动相B相所占的体积比为0％；

9～12min，流动相A相所占的体积比为100％→0％，流动相B相所占的体积比为0％→100％；

12～30min流动相A相所占的体积比为0％，流动相B相所占的体积比为100％；

30～40min流动相A相所占的体积比为100％，流动相B相所占的体积比为0％；

优选的，步骤(1)中所述标准品包括：新黄质、紫黄质、叶黄素、玉米黄质、叶绿素a、叶绿素b。

优选的，步骤(1)中溶解采用的溶剂为乙醇。

优选的，步骤(2)中提取色素是加入丙酮研磨提取。

优选的，步骤(2)中所述提取方法如下：取新鲜叶片置于4℃预冷的80％丙酮中，快速充分研磨，离心(4℃，18000×g×10min)，取上清，即得供试品溶液。

优选的，步骤(3)中所用色谱柱为GRACE-C18色谱柱，规格为4.6mm×250mm，5μm。

优选的，步骤(3)中所述检测波长为445nm。

优选的，步骤(3)中所述色谱条件还包括：流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～40℃，进样量为5～20μL。

优选的，所述色谱条件中流速为1.0ml/min，所述柱温为30℃，进样量为10μL。

与现有技术相比，本发明的技术效果为：

本发明解决了现有技术中色素分离难，降解快，制备困难，无法动态分析植物生长状态的技术难题。本发明所采用的方法具有高效便捷快速的分离特点，首先绿色植物前期处理方法简单，时间较短；其次采用高效液相分离分析方法，分离速度快，分离样品多，也可以实现多个样品图谱对比分析，简洁明了。

附图说明

图1为本发明标准品新黄质的3D光谱图；

图2为本发明标准品紫黄质的3D光谱图；

图3为本发明标准品叶黄素的3D光谱图；

图4为本发明标准品玉米黄质的3D光谱图；

图5为本发明标准品叶绿素a的3D光谱图；

图6为本发明标准品叶绿素b的3D光谱图；

图7为本发明实施例1所测定的高效液相色谱图；

图8为本发明实施例2所测定的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

本发明所使用仪器：

高效液相色谱仪：Thermo Ultimate3000，二极管阵列检测器(DAD)；。

电子天平：ME204E/02、ME403E/02(梅特勒-托利多仪器有限公司)；

超纯水机：Milli-Q(Millipore SAS)；

超声波清洗器：PS-20T型(120W，40KHz；深圳洁康公司)；

隔膜真空泵：GM-0.33A型(160W，50Hz；天津市津腾实验设备有限公司)

色谱柱：GRACE-C184.6mm×250mm，5μm。

实施例1

一种双子叶植物豌豆的叶绿素组分的分离提取方法，包括以下步骤：

(1)标准品溶液的配制：取新黄质、紫黄质、叶黄素、玉米黄质、叶绿素a、叶绿素b标准品适量，加乙醇分别制成每1ml含50μg的标准品溶液；标准品的3D光谱图示见附图1-6，分别对应的是新黄质、紫黄质、叶黄素、玉米黄质、叶绿素a、叶绿素b；

(2)供试品溶液的配制：将豌豆叶子精确称量100mg，置于研钵中，倒入4ml 80％丙酮(4℃预冷)，快速充分研磨，倒入2ml离心管中，18000g×10min，4℃离心，小心吸取上清，不能吸到沉淀；

(3)分别吸取标准品溶液、供试品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，其色谱条件如下：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：440～450nm；流动相：以甲醇-乙腈-四氢呋喃(81:14:5)混合溶液为流动相A，以甲醇-乙酸乙酯(70:30)混合溶液为流动相B；

其流动相所采用的线性梯度洗脱程序如下：

0～9min，流动相A相所占的体积比为100％，流动相B相所占的体积比为0％；

9～12min，流动相A相所占的体积比为100％→0％，流动相B相所占的体积比为0％→100％；

12～30min流动相A相所占的体积比为0％，流动相B相所占的体积比为100％；

30～40min流动相A相所占的体积比为100％，流动相B相所占的体积比为0％；

所述色谱条件中流速为1.0ml/min，所述柱温为30℃。

结果：见附图7，供试品特征图谱中呈现8个特征峰，其中6个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同；峰值保留时间约4.7min(新黄质)；峰值保留时间约5.0min(紫黄质)；峰值保留时间约7.5min(叶黄素)；峰值保留时间约8.0min(玉米黄质)；峰值保留时间约14.3min(叶绿素b)；峰值保留时间约15.8min(叶绿素a)。色谱峰之间分离度良好，表明此方法能够分离色素的组成部分，便于统计色素成分的含量，分析绿色植物的生长状况,是否处于逆境中，便于及时调整人工环境，帮助植物生长发育。

实施例2

一种莱茵衣藻的叶绿素组分的分离提取方法，包括以下步骤：

(1)标准品溶液的配制：取新黄质、紫黄质、叶黄素、玉米黄质、叶绿素a、叶绿素b标准品适量，加乙醇分别制成每1ml含50μg的标准品溶液；标准品的3D光谱图示见附图1-6，分别对应的是新黄质、紫黄质、叶黄素、玉米黄质、叶绿素a、叶绿素b；

(2)供试品溶液的配制：：取2ml处于生长平稳期的藻体，加入少量80％丙酮(4℃预冷)，剧烈震荡1min，冰上放置30min，用孔径0.45μm的滤膜过滤；

(3)分别吸取标准品溶液、供试品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，其色谱条件如下：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：445nm；流动相：以甲醇-乙腈-四氢呋喃(81:14:5)混合溶液为流动相A，以甲醇-乙酸乙酯(70:30)混合溶液为流动相B；

其流动相所采用的线性梯度洗脱程序如下：

0～9min，流动相A相所占的体积比为100％，流动相B相所占的体积比为0％；

9～12min，流动相A相所占的体积比为100％→0％，流动相B相所占的体积比为0％→100％；

12～30min流动相A相所占的体积比为0％，流动相B相所占的体积比为100％；

30～40min流动相A相所占的体积比为100％，流动相B相所占的体积比为0％；

所述色谱条件中流速为1.0ml/min，所述柱温为30℃。

结果：见附图8，供试品特征图谱中呈现8个特征峰，其中6个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同；峰值保留时间约4.5min(新黄质)；峰值保留时间约4.9min(紫黄质)；峰值保留时间7.2min(叶黄素)；峰值保留时间7.6min(玉米黄质)；峰值保留时间14.2min(叶绿素b)；峰值保留时间15.7min(叶绿素a)，色谱峰之间分离度良好，表明此方法能够有效分离色素的组成部分，便于统计色素成分的含量，研究藻类的生理特性进而从植物进化方向阐释藻类的进化历程。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。