本申请涉及生物技术研究领域，特别涉及一种钙离子通道的药物筛选试剂。
背景技术：
ca2+作为细胞内的第二信使，在细胞的生命活动中起着重要作用，不仅直接激活具有重要生理意义的细胞内的机械活动，如肌肉收缩等，同时也作为细胞内第二信便介导第一信使(如激素等细胞外信号)对细胞内的反应，其影响几乎涉及到细胞所有的生理和生化过程，如物质代谢、肌肉收缩、胞吞、胞饮、神经递质释放、染色体移动、dna合成、细胞分裂以及细胞凋亡等，而且某些疾病的发生和发展都会引起细胞内游离钙浓度(简写为[ca2+])和分布的大幅度变化，甚至因此导致细胞死亡。随着科技和社会的进步，人们对钙代谢、钙通道、钙受体及其调控作用，钙的转运和利用以及钙与某些疾病发生和发展关系的认识越来越深入，研究细胞内ca2+的含量及其时空分布的精确测定方法和技术已是当今化学、生物学、基础和临床医学等学科的一个十分重要的前沿热点研究课题。从20世纪50年代起，人们就开始研究测定细胞内ca2+的方法和技术，先后建立和发展了多种方法，如ca2+激活生物发光蛋白法、有机显色剂法、核磁共振法、放射示踪法、微电极法和荧光探针法等，这些方法各有其优缺点，实际应用时通常要根据各种方法的特点，按照所进行实验的具体要求和目的而选择不同的测定方法，其中荧光探针法是目前最常用的一种方法。
通常细胞内游离钙的浓度[ca2+]仅为10-7mol/l，而细胞外ca2+浓度高达10-3mol/l，而且随着细胞的活动，胞质游离钙的浓度还会发生较大变化，正是由于其分布的不均一性及其时空变化构成了细胞内ca2+信号的基础，ca2+作为胞内第二信使对细胞代谢和功能进行调节正是通过胞内游离ca2+含量及分布的变化，以及由此而引发的与蛋白质或酶的特异性结合而实现的。如此大的浓度梯度受细胞膜对钙的通透性和传输性质控制。细胞膜、细胞核、内质网和线粒体上都具有主动的钙转运机制，当胞内钙离子浓度上升时，这些转运系统可以将钙运出胞浆；当胞内钙离子浓度下降时，又能将存贮在″钙库″中的″存贮ca2+″释放入胞质中成为游离钙，从而保持细胞内游离钙浓度ca2+的稳定。
测定细胞内游离钙ca2+测定在技术上的要求：
(1)对活细胞无损伤或生理条件下研究细胞钙，不干扰细胞内正常的生理、生化过程；
(2)灵敏度高，检出限应达10-7mol/l；
(3)选择性好，由于细胞内其它一些无机离子如mg2+，na+，k+等的浓度均在10-3mol/l水平，故要求测定方法特异性和选择性要强；
(4)响应速度快，为了测定钙浓度的变化，要求测定方法对ca2+浓度变化的响应快于细胞内ca2+信号引起的相关生理和生化反应；
(5)时空分辨率高，能实时、原位地提供胞内各亚细胞区域钙信号聚散涨落的彼此独立又相互关联的信息。
信号转导是活细胞所执行的重要生物功能之一。细胞外的信号通常是通过各种各样的化学刺激来传递到细胞内部的。活细胞的表面有多种多样的受体，而信号正是通过这些受体的活化来传递到细胞内部，然后信号转变为另外一种形式的信息以引起相应的细胞应答。第二信使在细胞内的信号转导中起到非常重要的作用，它主要是通过离子浓度的变化来传递信息的。因此能够监控细胞内的离子浓度对研究第二信使以及胞内信号转导的研究具有极为重要的意义。钙离子是人体内最重要的离子之一，是人体内重要的元素，广泛分布于人体的细胞和体液中。随着人们对钙代谢、钙通道、钙受体及其调控，钙的转运和利用及其某些疾病发生和发展关系的认识愈来愈深入，细胞内ca2+的研究已成为化学、生物学、基础和临床等学科重要的前沿热点研究课题。细胞内自由钙离子浓度([ca2+])及其变化在细胞功能中起着十分重要的作用，精确测定活性细胞内钙离子的浓度及其流入已成为生物学及医学基础研究的重要内容之一。目前大约30％的fda批准的药物是基于钙离子通道的，尤其是心血管方面的药物；农药中也有相当部分是基于钙离子通道的，例如最近杜邦公司刚刚上市的新农药氯虫酰胺，就是能选择性的封闭害虫的钙离子通道，让昆虫缺钙而死亡，但是对鱼类和动物无任何影响，是2008年刚刚批准上市的绿色农药。
钙荧光指示剂法是目前应用广泛的测定活性细胞内钙离子浓度的重要方法。近年来这方面的研究进展很快，并且开拓了有机试剂研究的新领域。
目前来说，细胞ca2+定主要是通过荧光探针标记，然后荧光显微成像分析来实现的，探针的性能至关重要。探针若不能够区分标记特定亚细胞区域，荧光显微镜也就根本无法获取得到有关区域的ca2+信息。而目前广泛采用的以fura2和fluo3为代表的小分子ca2+荧光探针均与细胞融合性不好，有一定毒性，均不具有亚细胞区域靶向定位性，或与ca2+结合后无荧光峰的位移，难以采用双波长比率法进行测定；或对于细胞内胞浆、胞核钙无特异性。这对于细胞ca2+信号研究，不仅得不到确切的信息，甚至会导致错误的结论。因此，研发灵敏度更高、选择性更强、毒性更低的ca2+探针十分必要和迫切，并且该利用该ca2+探针研发快速分析钙离子浓度的检测试剂。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供一种钙离子通道的药物筛选试剂，该试剂用于测定钙离子浓度，并且测定的灵敏度高、选择性强，还对生物体的细胞毒性低。
本发明通过以下技术手段实现：一种钙离子通道药物筛选试剂，所述钙离子通道药物筛选试剂的组成包括：
苯酚，甲苯，邻苯二酚，乙腈，甲醇，n，n-二甲基甲酰胺，四氢呋喃，二氯甲烷，丙酮，盐酸，氢氧化纳。
优选的，
在三口瓶中，加入邻苯二酚，苯酚和n，n-二甲基甲酰胺试剂，经反应和ph值调试后，加入乙酸乙酯，用5％naoh洗涤萃水层无色为止，再用h2o洗滤液，获黄色溶液，w1为洗涤废水。用无水硫酸钠干燥上述溶液，无水硫酸钠容易吸水，可吸收滤液中的水分成固体，过滤上述被干燥溶液，s5滤饼做为固废处理，获黄色透明溶液备用。用旋转蒸发仪旋蒸除去溶剂乙酸乙酯(除去的g3废乙酸乙酯收集回收利用)，旋转蒸发仪内为真空状态，无其他废气产生，最终旋蒸后获棕红色粘液，冷却到10℃左右，凝结成固体，呈蜡黄色状固体(中间体1)进行检测。
优选的，
所述第一步反应完成后，将三口瓶放在磁力搅拌器上搅拌至溶解，搅拌条件为25℃，12小时。
优选的，
将反应1中得到的中间体1、甲苯及四氢呋喃(thf)加入三口瓶中，此工序产生废试剂瓶s6和挥发废气g4。添加完成后，将三口瓶放在磁力搅拌器上搅拌至溶解。加入超纯水，加热升温至回流，溶液呈红色浑浊液，然后进行tlc检测反应，此工序将产生废的薄层板s7。反应完全后冷却至室温，将反应液倒入冰水中，析出大量黄色固体，过滤，滤饼用3％氢氧化钠(naoh)洗涤2次，再用水洗至水相ph＝7，收集滤饼，滤液w2弃用，将滤饼进行真空干燥至衡重，得到中间体2进行检测。
优选的，
将中间体2加入单口瓶中，再加入乙腈试剂，混合均匀后，加入乙酸乙酯，此工序将产生废试剂瓶s8和挥发废气g5，搅拌20分钟后，用滴液漏斗将石油醚滴加进单口瓶中，产生挥发废气g6。逐渐升温至回流，反应12小时后进行tlc检测反应，此工序将产生废的薄层板s9。将检测后的反应液倒入乙酸乙酯中，析出大量白色固体，过滤，s10滤饼做为固废处理，将滤液浓缩干，然后加入甲醇，冰水浴搅拌30分钟，析出黄色固体，过滤，滤饼用甲醇洗涤，得白色固体为中间体3，w3滤液回收利用，直接用于下一步纯化。
优选的，
向三口瓶中加入二氯甲烷，冰盐浴冷却至
优选的，
改变浓度及配比进行反复重复试验，然后汇总数据，并对数据进行分析，然后得出相应的结论后对方案细节进行调整，直到得出成功的实验数据。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
1)利用本发明的试剂测定细胞内钙离子浓度，具有非常好的荧光性能，其对细胞的毒害性小，荧光分辨率比传统测定方法提高100倍，背景更低。
2)利用本发明的试剂测定细胞内钙离子浓度，负载容易，只需与细胞简单孵化即可进入细胞，无损伤且避免了微注射等繁杂手续。
3)利用本发明的试剂测定细胞内钙离子浓度，可在近中性的生理条件下与ca2+高选择性定量配位，响应其变化，据此可以实现在生理条件下对活细胞内游离ca2+的测量。
4)利用本发明的试剂测定细胞内钙离子浓度，显色后采用荧光显微成像技术，可提供细胞内ca2+分布的二维或三维图像，并可实时显示，空间分辨率优于其它所有方法。
5)利用本发明的试剂测定细胞内钙离子浓度，反应速度快，反应速度时间＜5ms，反应时间慢则无法反应活细胞的实时生理过程，而钙微电极的响应时间需要几秒，nmr法需要几分钟。
6)利用本发明的试剂测定细胞内钙离子浓度，该方法能与其它多种先进技术联合应用，如图像分析技术、流式细胞仪技术等，有利于对照观察亚细胞结构。
具体实施方式
本项目中涉及到的试剂配制全部在通风橱中进行。
第一步：首先在三口瓶中，加入邻苯二酚，苯酚和n，n-二甲基甲酰胺(dmf)试剂，此工序将产生废试剂瓶s1和挥发废气g1，添加完成后，将三口瓶放在磁力搅拌器上搅拌至溶解，搅拌条件为25℃，12小时。反应完成后进行薄层板检测(tlc检测)，薄层板检测是指将搅拌好的溶液滴在薄层板
第二步：将反应1中得到的中间体1、甲苯及四氢呋喃(thf)加入三口瓶中，此工序产生废试剂瓶s6和挥发废气g4。添加完成后，将三口瓶放在磁力搅拌器上搅拌至溶解。加入超纯水，加热升温至回流，溶液呈红色浑浊液，然后进行tlc检测反应，此工序将产生废的薄层板s7。反应完全后冷却至室温，将反应液倒入冰水中，析出大量黄色固体，过滤，滤饼用3％氢氧化钠(naoh)洗涤2次，再用水洗至水相ph＝7，收集滤饼，滤液w2弃用，将滤饼进行真空干燥至衡重，得到中间体2进行检测。
第三步：将中间体2加入单口瓶中，再加入乙腈试剂，混合均匀后，加入乙酸乙酯，此工序将产生废试剂瓶s8和挥发废气g5，搅拌20分钟后，用滴液漏斗将石油醚滴加进单口瓶中，产生挥发废气g6。逐渐升温至回流，反应12小时后进行tlc检测反应，此工序将产生废的薄层板s9。将检测后的反应液倒入乙酸乙酯中，析出大量白色固体，过滤，s10滤饼做为固废处理，将滤液浓缩干，然后加入甲醇，冰水浴搅拌30分钟，析出黄色固体，过滤，滤饼用甲醇洗涤，得白色固体为中间体3，w3滤液回收利用，直接用于下一步纯化。
第四步：向三口瓶中加入二氯甲烷，冰盐浴冷却至
第五步：改变浓度及配比对上述四步反应进行反复重复试验，然后汇总数据，并对数据进行分析，然后得出相应的结论后对方案细节进行调整，直到得出成功的实验数据，并整理成技术可行性报告。
本项目平均每天配制试剂时间为2小时，合成反应时间根据中控检测，进行实时调整，大约为2个小时，分析检测时间为4小时。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。