用于糖抗原72-4检测的样品稀释组合物、检测试剂和包含检测试剂的试剂盒的制作方法

本发明涉及医学检验领域，特别涉及用于糖抗原72-4检测的样品稀释组合物、检测试剂以及包含检测试剂的试剂盒。
背景技术：
：糖类抗原ca72-4(carbohydrateantigen72-4,ca72-4)是一种高分子量的黏蛋白(分子量为220-400kd),由colcher等人在1981年发现。因其可特异性的与两株单克隆抗体b72.3和cc49结合，故称为ca72-4。其抗原决定簇为唾液酸化的寡糖结构。在胃癌患者中有较高的阳性率。在一些结肠癌、粘液性卵巢癌也有表达。在多种恶性肿瘤疾病(包括胃癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、胆囊癌、乳腺癌、宫颈癌等)发现ca72-4的血清水平有升高。ca72-4升高与疾病的分期有关系。外科手术后，ca72-4水平可迅速下降至正常值。如果肿瘤组织完全切除，ca72-4可持续维持在正常水平。在70％的复发病例中，ca72-4浓度首先升高，或在临床诊断为复发时也已升高。另外，血清ca72-4升高可见于以下良性疾病：胰腺炎、肝硬化、肺病、风湿病、妇科病卵巢良性疾病、卵巢囊肿、乳腺病和胃肠道良性功能紊乱等。与其他标志物相比，ca72-4对良性疾病的诊断特异性较高。糖抗原72-4检测实验室常用的检查方法主要为酶联免疫法(elisa)和化学发光法(clia)，其中酶联免疫法的试剂盒存在灵敏度低和线性范围窄的缺点，而化学发光法的试剂盒每次实验操作都要使用校准品进行定标操作繁琐，反应时间较长。并且这种方法均为半自动操作，不利于实验室检验流水线化的提升。因此，提供一种用于糖抗原72-4检测的检测试剂以及包含检测试剂的试剂盒具有重要的现实意义。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种用于糖抗原72-4检测的样品稀释组合物、检测试剂以及包含检测试剂的试剂盒。本发明试剂盒可实现ca72-4的自动化检测，操作简便，检测速度快(40min即可出检测结果)，检测范围宽，hook风险小，更便于临床使用。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种用于糖抗原72-4(ca72-4)检测的样品稀释组合物，包括如下组分：所述蛋白质类稳定剂包括酪蛋白、鱼明胶或牛血清白蛋白中的一种或两者以上混合物；所述阻断剂为中和hama干扰的人抗鼠抗体。在本发明的一些具体实施方案中，所述缓冲液包括tris-nacl、bis-tris、pbs、mops、mes或taps中的一种；所述防腐剂包括proclin300、mit、bro、ipbc或nan3中的一种或两者以上的混合物；所述edta为乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾中的一种或两者的混合物；所述色素为胭脂红色素或果绿色素。在上述研究的基础上，本发明提供了所述的样品稀释组合物在制备用于糖抗原72-4(ca72-4)检测的试剂或试剂盒中的应用。此外，本发明还提供了所述的样品稀释组合物在制备用于肿瘤诊断或术后监测中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述肿瘤为胃癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌或宫颈癌。本发明还提供了用于糖抗原72-4(ca72-4)检测的试剂组合物，包括所述的样品稀释组合物、包被有ca72-4捕获抗体的磁珠混悬液、含有示踪标记物标记的ca72-4标记抗体的酶结合物溶液和含有梯度浓度的ca72-4抗原的校准品。在本发明的一些具体实施方案中，所述包被有ca72-4捕获抗体的磁珠混悬液包括磁珠原液、ca72-4抗体和封保液；所述封保液包括如下组分：所述含有示踪标记物标记的ca72-4标记抗体的酶结合物溶液包括示踪标记物标记的ca72-4抗体和酶结合物稀释液，所述酶结合物稀释液包括如下组分：所述含有梯度浓度的ca72-4抗原的校准品包括ca72-4抗原和标准品稀释液，所述标准品稀释液包括如下组分：缓冲液0.01～0.1m防腐剂1～3‰(w/v)酪蛋白1～3‰(w/v)所述缓冲液包括tris-nacl、bis-tris、pbs、mops、mes或taps中的一种；所述防腐剂包括proclin300、mit、bro、ipbc或nan3中的一种或两者以上的混合物；所述包被有ca72-4捕获抗体的磁珠混悬液的制备方法为：取所述磁珠原液经pbs缓冲液洗涤、偶联剂活化、mes缓冲液洗涤后与所述ca72-4抗体混合，加入终止液终止，经所述封保液封闭；所述含有示踪标记物标记的ca72-4标记抗体的酶结合物溶液由所述示踪标记物标记的ca72-4抗体与所述酶结合物稀释液按照0.01％～0.2％(w/v)的比例稀释制成；所述含有梯度浓度的ca72-4抗原的校准品由所述ca72-4抗原按照1:200添加到所述校准品稀释液中，配制成浓度为300u/ml的校准品，再利用校准品稀释液分别稀释成150u/ml、50u/ml、15u/ml、5u/ml、0u/ml的校准品。在本发明的一些具体实施方案中，所述示踪标记物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯或者金刚烷中的至少一种。在本发明的一些具体实施方案中，所述磁微粒为粒径在0.1～5μm之间、表层覆盖有高分子材料的fe3o4或fe2o3磁性粒子，在所述的磁微粒表面含有一种或多种活性功能集团。其中包被ca72-4捕获抗体的浓度为0.2～2.0μg/t。在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的试剂组合物在制备用于糖抗原72-4(ca72-4)检测的试剂或试剂盒中的应用。本发明还提供了所述的试剂组合物在制备用于肿瘤诊断或术后监测中的应用；所述肿瘤为胃癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌或宫颈癌。本发明还提供了用于糖抗原72-4(ca72-4)检测的试剂盒，包括所述的试剂组合物或所述的试剂组合物以及可接受的助剂。在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒还包括定标卡，可通过定标卡自动获取测试所需的参数。本发明提供了一种用于糖抗原72-4(ca72-4)检测的样品稀释组合物，相较于目前市场上已公开产品，具有操作简单使用方便的特点，节省了人力物力；同时出结果快，为检验人员节省了大量时间；样本稀释液中添加了乙二胺四乙酸二钠或/和乙二胺四乙酸二钾，消除新旧样本差异；样本稀释液中添加了阻断剂，针对性的消除异嗜性抗体对检验结果的干扰，提高了检验结果的准确性；试剂盒线性范围宽，hook风险小，更加适合临床上的应用。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1、图2示本发明试剂盒的线性范围考核结果；图3、图4示本发明试剂盒与对照试剂盒的相关性对比结果；图5、图6示本发明试剂盒的hook考核结果。具体实施方式本发明公开了一种用于糖抗原72-4检测的样品稀释组合物、检测试剂以及包含检测试剂的试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明所述的一种糖抗原72-4(ca72-4)检测试剂盒，包括磁微粒ca72-4校准品、包被ca72-4抗体的磁微粒混悬液、样品稀释液、含有示踪标记物标记的ca72-4酶结合物；所述的示踪标记物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯或者金刚烷中的至少一种。所述的磁微粒为粒径在0.1～5μm之间、表层覆盖有高分子材料的fe3o4或fe2o3磁性粒子，在所述的磁微粒表面含有一种或多种活性功能集团。所述的样本稀释液中的edta包括乙二胺四乙酸二钠或/和乙二胺四乙酸二钾。所述的样本稀释液中的阻断剂为中和hama干扰的人抗鼠抗体。所述的试剂盒采用的是双抗体夹心法，拓宽了检测范围，更利于临床上的使用。所述的试剂盒采用的是磁微粒化学发光法，可搭配相应的全自动化学发光仪，使用方便，检测用时短。所述的试剂盒采用的是两步法，大大降低了检测过程中出现hook的风险。所述的试剂盒由4个组分构成。所述的4个组分分别是包被有ca72-4捕获抗体的磁珠混悬液，含有edta的样品稀释液，含有示踪标记物标记的ca72-4标记抗体的酶结合物溶液，含有梯度浓度的ca72-4抗原的校准品。更加具体的，所述的4个组分的稀释液均为tris-nacl、bis-tris、pbs、mops、mes或taps中的一种，四个组分稀释液中含有防腐剂为proclin300、mit、bro、ipbc或nan3中的一种或两种以上，四个组分稀释液中含有蛋白质类稳定剂为酪蛋白、鱼明胶或牛血清白蛋白中的一种或两种以上，样品稀释液中含有edta包括乙二胺四乙酸二钠或/和乙二胺四乙酸二钾,样品稀释液中含有阻断剂，其中阻断剂的浓度为5～800μg/ml；磁微粒为表层覆盖有高分子材料的fe3o4或fe2o3磁性粒子，在所述磁微粒表面含有一种或多种活性功能基团，其中包被抗体浓度为0.2～2.0ug/t；酶结合物是由示踪标记物标记的ca72-4抗体与酶结合物稀释液按照0.01％-0.2％的比例稀释制成；校准品是浓度为0～300u/ml之间的6个不同浓度点。所述的试剂盒还含有定标卡，仪器可通过定标卡自动获取测试所需的参数。所述的磁微粒化学发光法试剂盒在如下(a)或(b)中的应用也属于本发明的保护范围：(a)制备用于胃癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌等肿瘤疾病的辅助诊断和术后监测的产品；(b)用于胃癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌等肿瘤疾病的辅助诊断和术后监测的产品。本发明试剂盒配套autolumoa2000系列全自动化学发光测定仪可实现ca72-4的自动化检测，操作简便，检测速度快(40min即可出检测结果)，检测范围宽，hook风险小，更便于临床使用。本发明提供的试剂盒有以下几个优点：第一，本发明试剂盒采用磁微粒化学发光的方法，搭配autolumoa2000系列全自动化学发光测定仪，实现了全自动化；使用方便，操作简单；第二，本试剂盒检测耗费时间短，大大节省了检验人员的时间(约40min出结果，利用化学发光法检测的厂家km和hkt均是70min出结果，利用酶联免疫法检测的厂家xw是75min出结果)；第三，本发明试剂盒采用双抗体夹心法，线性范围宽，在临床上实用性强；第四，本发明试剂盒采用一种特有的样品稀释液，不仅可以消除新旧样本差异，而且有效地降低了hama引起的假阳性干扰，大大提高了ca72-4的检测准确度；第五，本试剂盒采用的是两步法，降低了临床上发生hook的风险。本发明提供的用于糖抗原72-4检测的样品稀释组合物、检测试剂以及包含检测试剂的试剂盒中所用原料及试剂均可由市场购得。其中，ca72-4抗原、包被抗体、酶标抗体均来自于伊美诺公司。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1糖抗原72-4检测的试剂盒的制备及使用方法一、糖抗原72-4检测试剂盒的制备本发明试剂盒由酶结合物、样品稀释液、磁珠混悬液和校准品4个组分构成。(一)常规器材及试剂1、酶结合物(装于12ml磁珠瓶中)；2、样品稀释液(装于12ml磁珠瓶中)；3、磁珠混悬液(装于4ml磁珠瓶中)；4、试剂架(用于固定酶结合物、样品稀释液、磁珠混悬液三个组分)；5、校准品(装于4mlhdpe瓶中)；6、定标卡；(二)酶结合物的制备酶结合物稀释液的配制：采用浓度为0.01～0.1m的缓冲液tris-nacl、bis-tris、pbs、mops、mes或taps中的一种，添加1～3‰(w/v)的防腐剂(可采用proclin300、mit、bro、ipbc或nan3中的一种或两种以上的混合物)，1～3‰(w/v)蛋白质类稳定剂(酪蛋白、鱼明胶或牛血清白蛋白中的一种或两种以上混合物)，0.1-0.5‰的胭脂红色素。2.1酶结合物稀释液1的配置称取tris0.65g(北京益利精细化学品有限公司)、氯化钠0.8g(北京益利精细化学品有限公司)，加入80ml纯化水，调节ph＝7.4，依次加入鱼明胶(sigma)0.1g、proclin3000.2ml(sigma)、mit0.2ml，然后定容至100ml，搅拌至溶解备用；2.2酶结合物稀释液2的配置称取bis-tris13.1g(sigma)、氯化钠0.8g(北京益利精细化学品有限公司)，加入80ml纯化水，调节ph＝7.4，依次加入鱼明胶(sigma)0.3g、proclin3000.2ml(sigma)、mit0.2ml、nan32ml然后定容至100ml，搅拌至溶解备用；将由示踪标记物标记的ca72-4抗体用酶结合物稀释液1按照0.1％-0.5％的比例稀释，得到酶结合物1备用。将由示踪标记物标记的ca72-4抗体用酶结合物稀释液2按照0.1％-0.5％的比例稀释，得到酶结合物2备用。(三)样品稀释液的制备采用浓度为0.01～0.1m的缓冲液tris-nacl、bis-tris、pbs、mops、mes或taps中的一种，添加1～3‰(w/v)的防腐剂(可采用proclin300、mit、bro、ipbc或nan3中的一种或两种以上的混合物)，1～3‰(w/v)蛋白质类稳定剂(酪蛋白、鱼明胶或牛血清白蛋白中的一种或两种以上混合物)，添加0.1～3％(w/v)edta(乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾)，500μg/ml的阻断剂，0.1-0.5‰的果绿色素。3.1样品稀释液1：tris0.65g(北京益利精细化学品有限公司)、氯化钠0.8g(北京益利精细化学品有限公司)，加入80ml纯化水，调节ph＝7.4，依次加入鱼明胶(sigma)0.1g、proclin3000.2ml(sigma)、mit0.2ml，乙二胺四乙酸二钠1g、果绿色素0.01g，然后定容至100ml，搅拌至溶解；再加入100μg/ml的阻断剂，搅拌混匀。3.2样品稀释液2：称取tris6.5g(北京益利精细化学品有限公司)、氯化钠0.8g(北京益利精细化学品有限公司)，加入80ml纯化水，调节ph＝7.4，依次加入proclin3000.2ml(sigma)、mit0.2ml、ipbc0.2ml、酪蛋白(sigma)0.6g、乙二胺四乙酸二钠3g、果绿色素0.05g，然后定容至100ml，搅拌至溶解；再加入800μg/ml的阻断剂，搅拌混匀。3.3样品稀释液3：称取tris0.65g(北京益利精细化学品有限公司)、氯化钠0.8g(北京益利精细化学品有限公司)，加入80ml纯化水，调节ph＝7.4，依次加入proclin3000.2ml(sigma)、mit0.2ml、bro0.02g、酪蛋白(sigma)0.6g、乙二胺四乙酸二钾1g、果绿色素0.01g，然后定容至100ml，搅拌至溶解；再加入500μg/ml的阻断剂，搅拌混匀。(四)磁微粒混悬液的制备1、封保液的制备4.1封保液1：称取tris0.65g(北京益利精细化学品有限公司)、氯化钠0.8g(北京益利精细化学品有限公司)，加入80ml纯化水，调节ph＝7.4，依次加入proclin3000.2ml(sigma)、mit0.2ml、酪蛋白(sigma)0.2g、甘油15ml，然后定容至100ml，搅拌至溶解备用；4.2封保液2：称取bis-tris13.1g(sigma)、氯化钠0.8g(北京益利精细化学品有限公司)，加入80ml纯化水，调节ph＝7.4，依次加入proclin3000.2ml(sigma)、mit0.2ml、ipbc0.02ml、酪蛋白(sigma)0.6g、蔗糖10g，然后定容至100ml，搅拌至溶解备用；2、磁微粒混悬液的包被2.1取600ul的磁珠原液，用pbs缓冲液洗涤5次；2.2用10mg/ml的偶联剂对磁微粒活化2小时；2.3用ph4～5的mes缓冲液将活化后的磁微粒洗涤2次；2.4按照0.2～0.8ug/t的量将ca72-4抗体加入到洗涤后的磁微粒中，室温震荡2h；2.5加入终止液，终止半小时；2.6.1取2.5中1/2量磁微粒，用封保液1封闭5次，制得磁微粒1，按照50t/ml的量分装待用；2.6.2取2.5中1/2量磁微粒，用封保液2封闭5次，制得磁微粒2，按照50t/ml的量分装待用；(五)校准品的制备校准品稀释液的配置5.1校准品稀释液1：称取tris0.65g(北京益利精细化学品有限公司)、氯化钠0.8g(北京益利精细化学品有限公司)，加入80ml纯化水，调节ph＝7.4，依次加入proclin3000.2ml(sigma)、mit0.2ml、酪蛋白(sigma)0.2g，然后定容至100ml，搅拌至溶解备用；5.2校准品稀释液2：称取tris6.5g(北京益利精细化学品有限公司)、氯化钠0.8g(北京益利精细化学品有限公司)，加入80ml纯化水，调节ph＝7.4，依次加入proclin3000.2ml(sigma)、mit0.2ml、bro0.02g、酪蛋白(sigma)0.6g，然后定容至100ml，搅拌至溶解备用；将ca72-4抗原按照1:200添加到校准品稀释液1中，配制成浓度为300u/ml的校准品，再利用校准品稀释液1分别稀释成150u/ml、50u/ml、15u/ml、5u/ml、0u/ml的校准品系列1，分装待用。将ca72-4抗原按照1:200添加到校准品稀释液2中，配制成浓度为300u/ml的校准品，再利用校准品稀释液2分别稀释成150u/ml、50u/ml、15u/ml、5u/ml、0u/ml的校准品系列2，分装待用。二、步骤一制备的检测ca72-4试剂盒的操作方法本试剂盒配套的有定标卡，仪器通过扫描定标卡可自动获取测试所需的参数，按照操作说明将校准品添加到样本杯里，放到样本架上，在autolumoa2000系列全自动化学发光测定仪上定标；定标后样本可直接放到样本架上在机器上检测，约40分钟后出结果。按照磁微粒、酶结合物、样品稀释液、校准品组装成试剂，如下所示：试剂1试剂2磁微粒1磁微粒2酶结合物1酶结合物2样品稀释液1样品稀释液2校准品系列2校准品系列1实施例2试剂盒灵敏度考核按照clsi标准《ep17-a：临床实验室检测限的评价》的性能确认(建立)的方法，进行lob、lod、loq的建立。本项目无标准物质，不能可溯源至si单位，loq不适用，考核功能灵敏度(fs)。建立方法如下：lob，准备5份接近0值的临床样本，每个样本重复3次，总共做4天，得到60个数据；lod，准备5份浓度范围为1～4倍lob的系列临床样本，每个样本重复3次，总共做4天，得到60个数据；fs：采用lod实验中的数据，5个浓度样本每天测3次，总共测4天，每个样本得到12个结果，计算每个样本的均值、sd和cv％，最接近20％的浓度为功能灵敏度结果见表1：表1试剂1灵敏度考核第一批第二批第三批lob0.11u/ml0.10u/ml0.12u/mllod0.25u/ml0.27u/ml0.26u/mlfs0.36u/ml0.35u/ml0.34u/ml考核3批试剂结果显示本试剂盒的lob、lod、fs分别是：0.12u/ml、0.27u/ml、0.36u/ml。因此将本试剂盒的lob、lod、fs分别是定为0.12u/ml、0.27u/ml、0.36u/ml。表2试剂2灵敏度考核第一批第二批第三批lob0.12u/ml0.11u/ml0.11u/mllod0.27u/ml0.27u/ml0.26u/mlfs0.35u/ml0.36u/ml0.35u/ml考核3批试剂结果显示本试剂盒的lob、lod、fs分别是：0.12u/ml、0.27u/ml、0.36u/ml。因此将本试剂盒的lob、lod、fs分别是定为0.12u/ml、0.27u/ml、0.36u/ml。实施例3试剂盒线性范围考核按照clsi标准《ep6-a：定量检测方法的线性评估》的方法，建立本试剂盒的线性范围。建立方法如下：取1例高值样本h(＞300u/ml)，1例低值样本l(＜0.36u/ml)，分别按照如下比例进行混合成12个浓度样本(10h、9h+1l、8h+2l、7h+3l、6h+4l、5h+5l、4h+6l、3h+7l、2h+8l、1h+9l、1h+39l、10l)，每个浓度样本检测4次，计算均值。将理论值与实测均值使用excel软件进行一次方程y＝ax+b回归分析，统计方程因子斜率a和相关性r，要求a＝1±0.1，r＞0.99。结果如附图图1、图2所示，可以看出本发明试剂盒线性范围可达0.3～300u/ml。实施例4试剂盒临床评价采用本发明试剂盒与罗氏公司生产的糖抗原72-4(ca72-4)检测试剂盒(电化学发光法)平行考核梯度样本142例，浓度范围为0-300u/ml。检测结果进行临床相关性分析和符合率分析。符合率结果如表3所示，相关性如附图图3、图4所示。表3交叉四格表法计算考核试剂1与对比试剂的符合率由表3可以看出，本发明试剂盒与对比试剂盒阴阳符合率及总符合率均较好。由图3可以看出，本发明试剂盒和罗氏试剂盒有较好的相关性，r2＝0.981，且量值偏差较小，临床一致性较好。表4交叉四格表法计算考核试剂2与对比试剂的符合率由表4可以看出，本发明试剂盒与对比试剂盒阴阳符合率及总符合率均较好。由图4可以看出，本发明试剂盒和罗氏试剂盒有较好的相关性，r2＝0.9820，且量值偏差较小，临床一致性较好。实施例5试剂盒样本稀释液的评价取在ca72-4项目上使用聚已二醇凝聚沉淀法确认存在干扰的4份样本结果，如表5中所示：表5聚已二醇凝聚沉淀法确认存在干扰的样本结果这4份干扰的样本使用本发明的样本稀释液1、样本稀释液2、样本稀释液3、和普通样本稀释液的结果，如表6中所示：备注：普通样本稀释液组分：采用浓度为0.01～0.1m的缓冲液tris-nacl、，添加1～3‰(w/v)的防腐剂(可采用proclin300或bro中的一种或两种的混合物)，1～3‰(w/v)蛋白质类稳定剂(酪蛋白、鱼明胶或牛血清白蛋白中的一种或两种以上混合物)。表6本发明的样本稀释液消除样本中干扰的效果由表6可以看出本发明的样品稀释液可以消除干扰样本的干扰，优于km试剂和hkt试剂，有助于ca72-4试剂检测结果的准确性。实施例6试剂盒hook考核取一例临床值高的样本(15000u/ml)，或是直接取一份高浓度抗原，按照表5中的稀释比例进行稀释；统计其理论值与检测值，结果如表5所示：表7稀释比例与检测值与理论值由表7和图5、图6可以看出，本发明试剂盒检测高浓度的样本或抗原，未发生hook现象。实施例7本发明提供的试剂盒和不同厂家试剂盒对同一样品(校准品、临床样本)的检测时间如表8：表8厂家kmhktxw本发明技术平台化学发光法化学发光法酶联免疫法磁微粒化学发光法方法学双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法反应时间60min60min60min32min底物反应时间10min10min15min5min总时间70min70min75min37min表8结果表明：本试剂盒检测耗费时间短，极显著节省了检验人员的时间(37min出结果，利用化学发光法检测的厂家km和hkt均是70min出结果，利用酶联免疫法检测的厂家xw是75min出结果)。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3