本发明涉及一种检测ache-ab的电化学发光试剂盒及用法，属于免疫分析技术领域。
背景技术：
重症肌无力(myastheniagravis,mg)是一种自身免疫性疾病，它是一种自身抗体介导、补体参与、细胞免疫依赖的神经肌肉接点(nmj)处神经递质的信号传递障碍。mg人群发病率为(32～64)/10万，我国目前约有60万mg患者[1]。其主要临床表现为骨骼肌无力、易疲劳，活动后加重，休息和应用胆碱酯酶抑制剂后症状明显缓解、减轻。其特点是发病率高、致残率高、预后差、易复发，已经严重威胁到人类的生活和健康，得到了医疗、科研工作者的广泛关注。mg是典型的抗体介导的自身免疫性疾病，主要靶抗原是nmj突触后膜的乙酰胆碱受体(achr)。但抗achr抗体并非存在于所有的mg患者中，且其与病情严重程度、是否合并胸腺瘤和发病年龄无关。
乙酰胆碱(ach)是一种神经递质，主要在运动神经终末处合成，其作用为传导神经冲动。乙酰胆碱酯酶(ache)广泛分布于人的神经组织，其主要功能是催化胆碱能神经末梢释放的ach的水解，维持正常的神经活动。任何一种因素影响到突触结构都会导致胆碱能神经元功能的不完整，如抗乙酰胆碱酯酶抗体(ache-ab)与突触部位的ache结合，造成ache失活，阻碍ach水解，ach持续作用于突触后膜，使突触后膜处于去极化状态不能恢复，而影响下一次的神经活动的传递[2]。lennon等发现将ache作为靶抗原，把抗乙酰胆碱酯酶的抗体注入大鼠体内，通过组织化学及形态学检查，发现ache活性降低引发了临床症状的产生[3]。mg患者中有13％血清中为ache-ab阳性，且多为achr-ab阴性，临床多见眼肌型mg[4]。
目前ache-ab的主要检测方法还是elisa检测，该方法具有灵敏度低，重现性差，操作繁琐等多个缺点。建立高灵敏度、高特异性的检测ache-ab方法是尚待解决的问题。电化学发光免疫分析法是继酶联免疫分析、放射免疫分析、荧光免疫分析之后的新一代标记免疫测定技术，具有高度敏感、特异性强、测定范围宽、试剂稳定、操作简单等优点。目前尚未有文献报道电化学发光免疫分析法检测ache-ab的研究。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是：为解决现有技术中尚未有高灵敏度、高特异性的定量检测ache-ab的方法或试剂盒的技术问题，提供一种检测ache-ab的电化学发光试剂盒及制法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种检测ache-ab的电化学发光试剂盒，包括：包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液，生物素标记的ache工作液，三联吡啶钌标记的抗人igg抗体工作液，ache-ab的校准品和/或质控品工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，以及清洗液。
优选地，所述包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液由ph为6.8～7.6，浓度为0.01mol/l～0.2mol/l的磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、hepes缓冲液、mopso缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05～1wt％的bsa(牛血清白蛋白)和/或酪蛋白、0.05～1wt％的brij-35(月桂醇聚氧乙烯醚)和/或tritonx-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)和/或tween-20(山梨醇酐单月桂酸酯聚氧乙烯醚)、0.05～0.5wt％的proclin300或叠氮化钠。
优选地，所述抗人igg抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体fab片段或多克隆抗体fab片段，优选来源于鼠、兔、羊。
优选地，所述生物素标记的ache抗原以及三联吡啶钌标记的抗人igg抗体，工作液由ph为6.0～7.6，浓度为0.01mol/l～0.2mol/l的磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、hepes缓冲液或mopso缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.5～5wt％牛血清白蛋白、0.5～5wt％氯化钠、1～5wt％蔗糖、0.05～2wt％小牛血清、0.02～1wt％酪蛋白、0.02～1wt％的brij-35和/或tritonx-100和/或tween-20、0.05～0.5wt％proclin300和/或叠氮化钠。
优选地，所述检测ache-ab的电化学发光试剂盒还包括ache-ab校准品工作液和/或质控品工作液，所述ache-ab校准品和/或质控品工作液由ph为6.0～7.6，浓度为0.01mol/l～0.2mol/l的磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、hepes缓冲液或mes缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液中含有0.5～5wt％牛血清白蛋白、10～50wt％人血清、0.5～3wt％氯化钠、2～20wt％乙二醇、0.02～1wt％的brij-35和/或tritonx-100和/或tween-20、0.05～0.5wt％proclin300和/或叠氮化钠。
优选地，所述化学发光底物液ph为6.0～7.2，浓度为0.05～0.4mol/l的磷酸盐缓冲液或tris缓冲液的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05～0.4mol/l三丙胺、0.01～2wt％的brij-35和/或tritonx-100和/或tween-20、0.05～0.5wt％proclin300和/或叠氮化钠。
优选地，所述清洗液是ph≥13，浓度为0.1mol/l～0.5mol/l的氢氧化钾溶液，所述清洗液含有0.01～2wt％的烷基聚乙二醇类表面活性剂。
本发明还提供一种上述检测ache-ab的电化学发光试剂盒的制法，包括：包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液的制备，生物素标记的ache工作液的制备，三联吡啶钌标记的抗人igg抗体工作液的制备，电化学发光底物液的配制，以及清洗液的配制，并将上述制备的试剂进行分装及组装。
优选地，所述生物素标记的ache抗原的制备方法为：将nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)活化的生物素与ache按照1:1～20:1的摩尔比在2～8℃或室温条件下混匀反应0.5～2小时，透析或过柱除去多余的nhs活化的生物素及副产物，得生物素标记的ache。
优选地，所述三联吡啶钌标记抗人igg抗体的制备方法为：将ru-nhs(nhs活化的三联吡啶钌)与ph为6.5～8.0的抗人igg抗体溶液按照1:1～20:1的摩尔比在室温或37℃条件下，避光混匀反应1～4小时，加入甘氨酸溶液终止反应，透析除去多余的ru-nhs及反应副产物，得三联吡啶钌标记的抗人igg抗体。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种检测ache-ab的电化学发光试剂盒、制法，所制备试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素-生物素信号放大系统，检测速度快、灵敏度高、线性范围宽、检测结果重复性好，能够实现血液中ache-ab的准确定量检测；尤其地，将该试剂盒应用于全自动电化学发光系统，加样、孵育、清洗和检测等步骤均可实现自动化，避免了人为操作带来的结果偏差，提高了工作效率，通过内置标准曲线到测试软件，只需测试样本即可定量检测样本中的ache-ab，使检测更快速、更可靠、更稳定。
具体实施方式
现在对本发明作进一步详细的说明。
实施例1检测ache-ab的电化学发光试剂盒的制备方法
1)包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液的制备
将链霉亲和素包被磁珠微粒的悬浮液，磁分离去除上清，用ph＝7.4，浓度为0.1mol/l的pbs缓冲液(0.1m，ph7.4)重悬至浓度为0.75mg/ml，所述缓冲液含有0.5wt％的bsa、0.05wt％的tritonx-100、0.05wt％proclin300和0.05wt％叠氮化钠。
2)生物素标记的ache抗原的制备
准确称取1mgache抗原，加入适量pbs缓冲液(0.1m，ph7.4)调整抗体总浓度至1mg/ml，并加入透析袋中进行透析，每隔3～4小时换一次透析液，更换3～4次，透析后将抗体转移至离心管或冻存管内；
准确称取1mgn-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(nhs-biotin)，加入适量水调整其浓度为2mg/ml，得nhs-biotin水溶液；
将nhs-biotin水溶液加入抗体中，使nhs-biotin与抗体按照5:1的摩尔比在室温混匀反应1小时，得生物素标记的ache抗原溶液粗产品；
将生物素标记的ache抗原溶液转移至透析袋，于pbs缓冲液(0.1m，ph7.4)透析，每隔3～4小时换一次透析液，更换3～4次，透析后收集生物素标记的ache抗原至离心管或冻存管内，≤-15℃冷冻保存备用。
3)三联吡啶钌标记抗人igg抗体的制备
用dmso配制浓度为10mg/ml的ru-nhs溶液；用pbs缓冲液(0.1m，ph7.4)配制浓度为1mg/ml的抗人igg抗体溶液；
于1ml抗人igg抗体溶液中加入10μl新配制的ru-nhs溶液，37℃避光反应2小时，然后加入20μl、2m的甘氨酸终止反应，将反应液于pbs缓冲液(0.1m，ph7.4)透析过夜，更换3～4次透析液，回收三联吡啶钌标记的抗人igg抗体溶液，≤-15℃冷冻保存备用。
4)生物素标记的ache抗原工作液以及三联吡啶钌标记抗人igg抗体工作液的制备
配制ph为6.5，浓度为0.1mol/l的磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含有2wt％bsa、0.1wt％酪蛋白、1wt％氯化钠、1wt％蔗糖、2wt％小牛血清、0.5wt％tritonx-100、0.2wt％proclin300；然后用该缓冲液配制抗体浓度为1mg/l的生物素标记的ache抗原工作液，以及抗体浓度为8mg/l三联吡啶钌标记的抗人igg抗体工作液。
5)校准品和质控品工作液的配制
配制ph＝7.4，浓度为0.1mol/l的n-(2-羟乙基)哌嗪-n′-(2-乙磺酸)(hepes)缓冲液，所述缓冲液含有1wt％bsa、20wt％人血清、1wt％氯化钠、5wt％乙二醇、0.1wt％tween-20、0.2wt％proclin300；然后用该缓冲液配制ache-ab校准品和质控品工作液，校准品共6个点，ache-ab的浓度分别为0ng/ml、0.2ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、25ng/ml、100ng/ml。质控品分高、低两个浓度，ache-ab的浓度分别为1ng/ml、25ng/ml。
6)清洗液的配制
配制176mmol/l的koh溶液，所配清洗液中含有0.15wt％brij-35。
7)化学发光底物液的配制
配制ph＝6.5，0.15mol/l三丙胺、0.05wt％brij-35、0.01wt％proclin300。
8)试剂分装及组装
将链霉亲和素包被的磁珠微粒工作液12ml/瓶、生物素标记的ache抗原工作液12ml/瓶、三联吡啶钌标记的抗人igg抗体工作液12ml/瓶、校准品/质控品工作液1.0ml/瓶分装后，组装在一起，保存于2～8℃，将化学发光底物液380ml/瓶、清洗液380ml/瓶单独包装，保存于20～25℃。
实施例2使用本发明的试剂盒检测ache-ab的方法以全自动电化学发光法免疫分析仪为检测仪器，将试剂盒装载到仪器上进行检测，步骤如下：
将样本(或校准品或质控品)、生物素标记的ache抗原工作液和三联吡啶钌标记的抗人igg抗体工作液加入到反应杯中，37℃孵育10分钟，形成抗原-抗体-抗抗体复合物溶液；
于抗原-抗体-抗抗体复合物溶液中加入链霉亲和素包被的磁珠微粒工作液，37℃孵育10分钟，形成磁性复合物悬浮液；
将磁性复合物悬浮液置于磁场内，清洗液流过并洗涤所述磁性复合物；
向洗涤后的磁性复合物中注入电化学发光底物液，使用光电倍增管检测其发光强度。由光电倍增管所得信号值和定标曲线推算出ache-ab的含量。
实施例3本发明的试剂盒的性能评估
1)试剂灵敏度的研究
试剂灵敏度是根据最低检测限(limitofblank,lob)来确定的，最低检测限按下述实验方法进行。检测零浓度校准品20次，得到20次测定结果的信号值(rlu)，计算其平均值m和标准差sd，得出m+2sd所对应的rlu值，根据零浓度校准品与相邻浓度校准品(0.2ng/ml)之间的浓度-rlu均值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将m+2sd所对应的rlu值带入上述方程中，计算得出对应的浓度，即lob。
以下表1中的测定结果显示，按上述方法检测试剂lob为0.010ng/ml，根据此结果确定试剂灵敏度可达到0.02ng/ml以下。
表1本发明试剂盒的灵敏度测定结果
2)本发明试剂盒的重复性的研究
检测抗ache抗体浓度为0.294ng/ml、3.473ng/ml两个浓度的样本，每个样本检测10次，分别计算每个样本的变异系数(cv)，结果表明该试剂盒变异系数cv均小于5％。
表2本发明试剂盒的重复测定结果
3)本发明试剂盒的准确度测定结果
由于该指标目前尚未有国家或国际标准品，采用第三方外购标准品对试剂盒的准确度进行测定。检测浓度为0.5ng/ml、2ng/ml、10ng/ml三个浓度的ache-ab标准品，分别计算检测值与理论值的偏差，结果表明该试剂盒检测标准品偏差均小于5％。
表3本发明试剂盒的准确度测定结果
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
参考文献
[1]张大启综述,杨丽审校.lrp4抗体阳性的重症肌无力研究进展[j].天津医科大学学报,2016,22(01):87-89.
[2]王巍炜,郝洪军,高枫.重症肌无力患者血清四种抗体的检测及意义[j].中国神经免疫学和神经病学杂志,2010,17(5):355-360.
[3]s.brimijoin,m.balm,p.hammond,v.a.lennon.selectivecomplexingofacetylcholinesteraseinbrainbyintravenouslyadministeredmonoclonalantibody[j].journalofneurochemistry.1990,54(1):236-241.
[4]李大年.现代神经内科学[m].山东科学技术出版社,第二版.2002,934-938.