糖链抗原CA153检测试剂盒的制作方法

本申请要求2019年3月29日提交的中国专利申请201910246917.2的优先权。本申请涉及临床检验领域。具体而言涉及一种ca153的定量检测试剂。
背景技术：
：ca，即carcinomaantigen的简称，也就是癌抗原153，是多种形式肿瘤的标志物，属于广谱标志物，在乳腺癌患者中表现比较显著。ca153是一种跨膜蛋白，表达于是高度分化的上皮细胞的顶端膜。在上皮肿瘤中会有过量的表达，如乳腺癌或者是卵巢癌，ca153包含有两种亚基，一种是alpha亚基，一种是beta亚基。乳腺癌常伴有ca153，但是在乳腺癌初期敏感性较低，大约只有60％，转移性的乳腺癌的阳性率可达80％。在欧洲，ca153一般是作为乳腺癌辅助诊断指标，也是术后随访，监测肿瘤复发，转移的指标。有文献指出，ca153水平超过30、40、50u/ml时，判断乳腺癌患者存在术后局部区域复发或远处转移，其敏感性均超过90％，特异性分别为95％、99％、100％，正确判断率分别达到56％、83％、100％。此外，ca153水平增高的乳腺癌患者发生转移的时间较ca153正常的患者水平要早许多。据研究分析，乳腺癌患者血清ca153水平变化与其局部淋巴结及远处转移情况之间存在改变的一致性，尤其是远处转移灶者，其ca153表达水平，及阳性率均显著增加，所以，ca153具有对乳腺癌转移起监视的作用，如其血清水平持续升高，则应开始或加强化疗、放疗或改用内分泌治疗等。目前医院大多数采用的化学发光检测，而且基本被国外的ivd行业巨头垄断，如罗氏，西门子，雅培等，在价格方面不具备自主性，容易造成医疗成本升高，增加患者检测负担。因此，研发一种能有效的，广泛的应用于各大医院检测ca153的试剂盒是很有必要的。技术实现要素：根据本申请的一些实施方案，提供了一种ca153检测试剂盒，其包含第一试剂和第二试剂，其中，所述第一试剂包含：所述第二试剂包含：在一些实施方案中，缓冲液选自：甘氨酸缓冲液、tris-hcl缓冲液、hepes缓冲液。在一些实施方案中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液可以相同或不同。在一些实施方案中，防腐剂选自：叠氮钠、硫柳汞、proclin300。在一些实施方案中，聚乙二醇选自：peg6000、peg8000、peg12000、peg20000，优选peg20000。在一些实施方案中，表面活性剂选自：tween20、tween80、np40、thesit，优选tween20。在一些实施方案中，保护剂选自：牛血清蛋白、卵清蛋白、脱脂乳、小牛血清。在一些实施方案中，所述阻断剂为羊抗鼠igg。在一些实施方案中，所述稳定剂选自：蔗糖、甘油、海藻糖、葡萄糖，优选海藻糖。在一些实施方案中，所述胶乳颗粒的表面官能团选自：氨基、羧基、氯甲基、环氧基，优选羧基。在一些实施方案中，所述胶乳颗粒的平均粒径为200nm至500nm，优选400nm。在一些实施方案中，所述ca153抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，本申请的试剂盒包含第一试剂和第二试剂，其中，所述第一试剂包含：所述第二试剂包含：所述ca153抗体是鼠源单克隆抗体；且聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径是400nm；聚苯乙烯胶乳颗粒是羧基修饰的。附图说明图1.本申请试剂盒的校准曲线。具体实施方式实施例1.第一试剂的制备1.称取17.87ghepes、13.15gnacl、3gpeg20000、7.5gtween20、1.5g叠氮钠、7.5gbsa、15ml阻断剂(5mg/ml)，溶于1.0l双蒸水中，调节ph至7.0，定容至1.5l即得试剂第一试剂(1)：2.或者，称取5.63g甘氨酸、13.15gnacl、3gpeg20000、7.5gtween80、1.5g叠氮钠、7.5gbsa、10ml阻断剂(同上)，溶于1.0l双蒸水中，调节ph至7.0，定容至1.5l制备第一试剂(2)：3.或者，称取9.09gtris、13.15gnacl、3gpeg20000、7.5gtween20、1.5g叠氮钠、7.5gbsa、10ml阻断剂(同上)，溶于1.0l双蒸水中，调节ph至7.0，定容至1.5l制备第一试剂(3)：实施例2.抗体包被颗粒的制备1.用hepes缓冲液将颗粒(400nm，羧基)稀释至1％(w/v)；2.用hepes缓冲液将抗体(鼠单抗)稀释至0.5mg/ml；3.将浓度为0.1％至1％(w/v)的edac水溶液加入至步骤1的颗粒中，在恒温摇床中37℃反应30min；4.反应结束后，加入步骤2的抗体，在恒温摇床中37℃反应3h；5.再加入封闭剂，常温过夜放置；6.将封闭过夜的颗粒，加入清洗液清洗离心3次，保存，备用。步骤1和步骤2顺序可互换或并行。实施例3.第二试剂的制备将实施例2制备的颗粒加入400ml双蒸水，补加18.76g甘氨酸、2.5gbsa、0.5g叠氮钠、50g海藻糖，搅拌混匀，调节ph至7.2，补加双蒸水至500ml，超声至主波长吸光度基本不变化即得第二试剂：实施例4.试剂盒的制备按照下表将前述试剂组装成试剂盒。表1.试剂盒的组装第一试剂第二试剂试剂盒1第一试剂(1)第二试剂试剂盒2第一试剂(2)第二试剂试剂盒3第一试剂(3)第二试剂测试例测试例1.检测限测试对上述实施例所制备的3个试剂盒采用全自动生化仪(比如，日立7180)进行测试。测定波长为660nm，样本取样量为5μl，在加入150μl的第一试剂，37℃恒温5min，然后加入50μl的第二试剂，42秒后读取吸光度a1，37℃孵育4分18秒后读取吸光度a2，反应吸光度为δa＝a2-a1；对上述的3个试剂盒进行性能验证，其结果如下：表2.检测限结果根据如上测定，可知试剂盒1至3区别仅在于缓冲液不同，然而只有试剂盒1呈现出乎意料的检测限，可达到2.0u/ml。测试例2.表面活性剂的筛选按照试剂盒1的制备方法，制备以下试剂盒，区别仅在于将表面活性剂tween20分别替换为tween80、np40、thesit，并测试对甘油三酯干扰物的抗干扰作用。表3.表面活性剂的筛选本领域技术人员知晓，在制剂领域中，表面活性剂的作用在于促进试剂体系中各组分或检测样本中各物质的均匀分散。因此，理论上具有增溶性质的表面活性剂都可以使用，例如吐温20、吐温40、tritonx-100、乙基苯基聚乙二醇等(参见《实验材料和方法》2013，3：163，第3页)。发明人出乎意料地注意到，尽管tween20、tween80、np40和thesit都归属于非离子型表面活性剂，却只有tween20实现了明显优势的抗甘油三酯干扰，和其它三种表面活性剂形成统计学上的显著差异。测试例3.阻断剂对假阳性结果的影响按照试剂盒1的制备方法配制对比试剂盒，差别仅在于不含阻断剂。用制备的各个试剂盒测试含有或者不含500iu/mlrf的样本。结果如下，显示阻断剂能够显著改善试验结果的假阳性，避免rf干扰。表4.阻断剂对假阳性结果的影响当前第1页12