一种霍山石斛根尖标本片及其制备方法和应用与流程

[0001]
本发明属于玻片制备技术领域，具体涉及一种霍山石斛根尖标本片及其制备方法和应用。


背景技术：

[0002]
霍山石斛(dendrobium huoshanense c.z.tang et s.j.cheng)为兰科石斛属多年生草本植物，为中国特有种，又称“米斛”，主产于安徽大别山地区。霍山石斛具有调和阴阳、壮阳补肾和益气除热之功能，其药用、食用历史悠久。研究表明，霍山石斛含有多糖类、生物碱类和黄酮类等成分，具有提高人体免疫力、抗氧化、抗肿瘤、降血糖和修复肝损伤等功效。自然界的霍山石斛多为二倍体，与二倍体植物相比，同源四倍体植株个体更大，活性成分含量较高。自然界中霍山石斛二倍体染色体数目为2n＝2x＝38，同源四倍体染色体数目为2n＝4x＝76。染色体是遗传物质在肉眼可见层面的载体和物质基础，通过对霍山石斛的染色体的研究，为霍山石斛多倍体育种提供可靠的依据，为探索植物遗传多样性、丰富植物基因库奠定基础。
[0003]
染色体计数法是目前确定植物染色体倍性最直接、最准确的方法，通过观察霍山石斛试管苗染色体，可以从细胞学水平上直接对霍山石斛二倍体与四倍体试管苗进行鉴定，也可以在染色体水平上为霍山石斛品种的起源演化以及分类研究提供重要的细胞学依据。现有的染色体鉴定方法步骤较为繁琐，使用的化学试剂对环境不友好，染色体细胞被化学试剂破环，根尖细胞染色体细胞膜的破环导致染色体出现较多嵌合体，不容易观察，从而鉴定成功率低，鉴定结果差。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种霍山石斛根尖标本片及其制备方法和应用，利用霍山石斛根尖标本片进行染色体鉴定时，能准确鉴定霍山石斛二倍体和四倍体染色体，为霍山石斛多倍体育种及技术克隆提供技术支持。
[0005]
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006]
本发明提供了一种霍山石斛根尖标本片的制备方法，包括以下步骤：(1)取霍山石斛苗长3～5mm的根，冲洗后浸入蒸馏水中，0～4℃环境中处理至少24h，得预处理根；
[0007]
(2)将预处理根投入卡诺固定液中，于0～4℃环境中固定24h；
[0008]
(3)将固定后的根尖置于含有青霉素的试管内，蒸馏水清洗，利用1mol/l的hcl水溶液解离，所述解离的温度为60℃，所述解离的时间为6～8min；
[0009]
(4)切取解离后的根尖上0.8～1.2mm的根尖生长区，利用醋酸洋红染色剂或改良苯酚品红染色液染色10min，盖上盖玻片，压片，得标本片。
[0010]
优选的，步骤(1)所述根在早晨8:00～9:00切取。
[0011]
优选的，步骤(1)所述根为培养的36h龄的霍山石斛试管苗根尖。
[0012]
优选的，经步骤(2)所述固定后，若不及时使用固定后的根尖，将所述固定后的根
尖依次经体积百分含量为90％的酒精水溶液和70％的酒精水溶液各浸洗一次，再置于新的体积百分含量为70％的酒精水溶液中，放置在0～4℃环境中保存。
[0013]
优选的，经所述保存后的根尖材料在使用前，可用所述固定液再处理一次，所述再处理的时间为6～8h。
[0014]
优选的，步骤(3)所述解离后还包括清水冲洗2～3次。
[0015]
优选的，步骤(4)盖上盖玻片后，用镊子在材料的地方轻压，使生长区的细胞分散开来，再在盖玻片上覆盖一层吸水纸，用解剖针或铅笔上的橡皮头多次敲击根尖部位，以盖玻片不破裂为准。
[0016]
本发明还提供了利用上述制备方法制备得到的霍山石斛根尖标本片。
[0017]
本发明还提供了所述霍山石斛根尖标本片在染色体鉴定中的应用。
[0018]
本发明还提供了一种基于所述霍山石斛根尖标本片染色体鉴定方法，包括以下步骤：将所述霍山石斛根尖标本片置于低倍显微镜下进行观察，选取不同分裂时期的典型细胞，换高倍镜观察。
[0019]
本发明提供了一种霍山石斛根尖标本片的制备方法，对常规的压片法进行改进，尤其是冷水预处理24h以上，0～4℃环境中利用卡诺试剂固定24h，青霉素试管中解离，染色10min后制片并观察。本发明所述制备方法，解离时间短，解离效果好，能清晰的将根尖分生组织区域分离出来；染色体分离效果好，稳定性、可重复性高、分裂像多；并且所用化学试剂属于环境友好型试剂。利用所述制备方法制备得到的标本片，可以在显微镜下准确鉴定霍山石斛二倍体和四倍体染色体，为霍山石斛多倍体育种及技术克隆提供技术支持。
附图说明
[0020]
图1为霍山石斛二倍体根尖染色体的鉴定图，标尺10μm；
[0021]
图2为霍山石斛四倍体根尖染色体的鉴定图，标尺10μm；
[0022]
图3为霍山石斛二倍体叶片气孔鉴定图，标尺20μm；
[0023]
图4为霍山石斛四倍体叶片气孔鉴定图，标尺20μm。
具体实施方式
[0024]
本发明提供了一种霍山石斛根尖标本片的制备方法，包括以下步骤：(1)取霍山石斛苗长3～5mm的根，冲洗后浸入蒸馏水中，0～4℃环境中处理至少24h，得预处理根；
[0025]
(2)将预处理根投入卡诺固定液中，于0～4℃环境中固定24h；
[0026]
(3)将固定后的根尖置于含有青霉素的试管内，蒸馏水清洗，利用1mol/l的hcl水溶液解离，所述解离的温度为60℃，所述解离的时间为6～8min；
[0027]
(4)切取解离后的根尖上0.8～1.2mm的根尖生长区，利用醋酸洋红染色剂或改良苯酚品红染色液染色10min，盖上盖玻片，压片，得标本片。
[0028]
本发明取霍山石斛苗长3～5mm的根，冲洗后浸入蒸馏水中，0～4℃环境中处理至少24h，得预处理根。本发明所述根优选在早晨8:00～9:00切取。本发明对所述根的来源并没有特殊限定，优选为培养的36h龄的霍山石斛试管苗根尖，所述根尖生长旺盛，分裂期细胞多，不受取材时间限制；解离时间短，解离效果好；能清晰的将根尖分生组织区域分离出来。本发明优选对所述切取的根尖在蒸馏水中冲洗三次，浸入蒸馏水中进行低温处理：置于
0～4℃冰箱中至少处理14h。本发明所述低温处理可对根尖染色体起到浓缩效果。
[0029]
得预处理根后，本发明将预处理根投入卡诺固定液中，于0～4℃环境中固定24h。本发明所述卡诺固定液优选现用现配，包括以下体积份的原料：3份无水乙醇和1份冰醋酸。本发明所述固定时优选将装有预处理根的卡诺固定液置于4℃冰箱中固定24h。在本发明中，经所述固定后，若不及时使用固定后的根尖，优选将所述固定后的根尖依次经体积百分含量为90％的酒精水溶液和70％的酒精水溶液各浸洗一次，再置于新的体积百分含量为70％的酒精水溶液中，放置在0～4℃环境中保存。本发明所述固定优选为用化学的方法把细胞迅速杀死，使蛋白质变性，并尽量保持原来的分裂状态，同时更易于着色。本发明经所述保存后的根尖材料在使用前，优选用所述卡诺固定液再处理一次，所述再处理的时间为6～8h。
[0030]
本发明将固定后的根尖置于含有青霉素的试管内，蒸馏水清洗，利用1mol/l的hcl水溶液解离，所述解离的温度为60℃，所述解离的时间为6～8min。本发明优选将固定后的根尖置于含有青霉素的试管内，蒸馏水清洗几次，吸干水分，加入1mol/l hcl溶液，在60℃下水解6～8分钟，解离成功的根尖，分生组织发白，伸长区已呈半透明，似烂状。本发明所述试管内青霉素含量优选为0.3～0.5mg/l，可抑制细菌增殖。本发明在所述解离后，优选还包括对解离后的根尖用水洗2～3次，以利于着色。
[0031]
本发明切取解离后的根尖上0.8～1.2mm的根尖生长区，利用醋酸洋红染色剂或改良苯酚品红染色液染色10min，盖上盖玻片，压片，得标本片。本发明在制片时，优选取一根尖放在洁净的载玻片上，用刀片切取1mm左右的生长区，其余部分弃掉，加半滴醋酸洋红染色剂(或改良苯酚品红染色液)染色10min，加盖玻片。盖上盖玻片后，本发明优选用镊子在材料的上方轻压几下，使生长区的细胞分散开来，再在盖玻片上覆盖一层吸水纸，用解剖针或铅笔上的橡皮头敲击根尖部位，重复几次，力一次比一次大，以盖玻片不破裂为准。
[0032]
本发明还提供了利用上述制备方法制备得到的霍山石斛根尖标本片。本发明所述标本片为临时玻片。
[0033]
本发明还提供了所述霍山石斛根尖标本片在染色体鉴定中的应用。
[0034]
本发明还提供了一种基于所述霍山石斛根尖标本片染色体鉴定方法，包括以下步骤：将所述霍山石斛根尖标本片置于低倍显微镜下进行观察，选取不同分裂时期的典型细胞，换高倍镜观察。本发明所述低倍显微镜优选为40倍镜以下，高倍为100倍镜及以上。
[0035]
下面结合实施例对本发明提供的霍山石斛根尖标本片及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0036]
实施例1
[0037]
1.预处理：于早晨8:00～9:00切取100株36h龄的霍山石斛试管苗上3～5mm长的根尖，将材料在蒸馏水中冲洗3次，将材料浸入蒸馏水内，放置到4℃冰箱中处理24h以上。
[0038]
2.固定：将根尖投入卡诺固定液(现用现配，无水乙醇：冰醋酸的体积比＝3：1)中4℃冰箱处理24h。
[0039]
3.解离：将固定后的根尖分装到含青霉素的试管(0.3～0.5mg/l)内，用清水洗几次，吸干水，加入1mol/l hcl溶液，在60℃下水解6～8分钟，解离成功的根尖，分生组织发白，伸长区已呈半透明，似烂状。解离后的根尖用水轻洗2～3次，以利于着色。
[0040]
4.染色、压片：取一根尖放在洁净的载玻片上，用刀片切取1mm左右的生长区，其余
部分弃掉，加半滴醋酸洋红染色剂(或改良苯酚品红染色液)，加盖玻片。用镊子在材料的地方轻压几下，使生长区的细胞分散开来，再在盖玻片上覆盖一层吸水纸，用解剖针或铅笔上的橡皮头敲击根尖部位，重复几次，力一次比一次大，以盖玻片不破裂为准。
[0041]
5.观察：将制好的标本片，置于显微镜下先作低倍观察，选取不同分裂时期的典型细胞，换高倍镜观察。
[0042]
观察到如图1和图2所示的根尖染色体图，其中图1为二倍体霍山石斛根尖染色体鉴定图，染色体数目为2n＝2x＝38，图2为四倍体霍山石斛根尖染色体鉴定图，染色体数目为2n＝4x＝76。
[0043]
对实施例1中的二倍体和四倍体进行叶片叶绿体数目验证：
[0044]
于早晨8～9点取霍山石斛二倍体和四倍体试管苗叶片，进行气孔观察。将叶片在固定液(冰醋酸：乙醇＝1:3)中处理1.5～2.0h至褪色，蒸馏水中浸泡5～6min，撕取叶片下表皮于载玻片上，1％碘-碘化钾染色5～6min盖上盖玻片，镜检。毎个叶片随机取10个视野统计气孔数目，观察100个上的气孔保卫细胞，统计叶绿体数。二倍体叶片气孔鉴定如图3所示，四倍体叶片气孔鉴定如图4所示。利用本发明所述鉴定方法，鉴定20个样本，会有8个以上能够成功鉴定出四倍体，准确率在40％以上。
[0045]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。