一种双指标酶电极检测装置和对生物反应器内底物和产物的在线测试方法与流程

本发明涉及生物传感器技术领域，尤其涉及一种双指标酶电极检测装置和对生物反应器内底物和产物的在线测试方法。

背景技术：

生物传感器是利用生物敏感材料作识别元件与适当的理化换能器及信号放大装置构成的分析工具或检测系统。其中，固定化酶传感器(酶电极)是研究最多、性能稳定，而且应用市场最大的生物传感器，优势是特异性好、样品前处理简单、快速、灵敏度高且可操作性强，在微生物发酵、细胞培养过程检测与控制领域已展现出广阔的应用前景。

生物反应(细胞培养、微生物发酵等)过程需要对底物和目标产物进行快速、准确的检测，以便对生物反应过程进行优化和控制。以谷氨酸发酵为例，常规检测采用酶电极双指标(底物葡萄糖和产物谷氨酸)在线检测装置是葡萄糖电极和谷氨酸酶电极安装在同一反应池腔内(如图2所示)。与此同时，由于发酵液检测样品的特点是样品量大、批次多，样品组分复杂、被测物浓度变化范围广等。在实际测定时，由于被检测物的浓度过高，需要经过稀释才能测定(谷氨酸和葡萄糖同时稀释)。将稀释后样品注入反应池腔，20秒后同时得到葡萄糖和谷氨酸测定结果。但发酵过程底物和目标产物的浓度变化呈现相反的变化趋势：发酵起始阶段，底物浓度高，产物浓度低(几乎为零)。随着发酵时间的进程，底物逐步消耗，浓度逐渐减低；产物逐步生成，浓度逐步提高。在发酵终点，产物浓度达到最大值，而底物接近零值。所以在利用如图2所示的常规检测采用酶电极双指标(底物葡萄糖和产物谷氨酸)在线检测装置进行实际检测时，由于被测物质浓度过高，需要在进行检测前就对样品先进行一定的稀释后再进入到所述检测装置中进行准确测定。发酵初期的产物和发酵终点的底物浓度已在仪器检测范围之内，不用稀释就可进行测定。但实际测试过程中，葡萄糖和谷氨酸测定时按统一操作步骤完成，且被测样品是按高浓度检测范围来确定稀释倍数。因此就会导致浓度低的样品由于过度稀释，造成不必要的稀释误差。特别是在发酵终点，要求底物浓度趋近于0(原料充分利用)。由于样品的稀释检测，造成了稀释误差，不利于精准判断底物(残留量)和发酵终点。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种双指标酶电极检测装置和对生物反应器内底物和产物的在线测试方法，所述双指标酶电极检测装置不需要在仪器外进行额外的稀释，提高了检测的精确度。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种双指标酶电极检测装置，包括反应池、底物酶电极3、产物酶电极4、缓冲液瓶6、标准液瓶7和样品液瓶8，所述反应池包括通过管道串联的第一反应池1和第二反应池2；

所述第一反应池1内设置底物酶电极3，第二反应池2内设置产物酶电极4；

所述缓冲液瓶6、标准液瓶7和样品液瓶8通过管道汇总后，再分别与第一反应池1和第二反应池2通过管道连接。

优选的，所述双指标酶电极检测装置还包括废液瓶9。

优选的，所述第一反应池1和第二反应池2内均设置有搅拌子5。

优选的，所述缓冲液瓶6和标准液瓶7的管路汇总处设置有第一泵阀10；

所述标准液瓶7和样品液瓶8的管路汇总处设置有有第二泵阀11；

所述第二泵阀11与第二反应池2之间的管道上设置有第三泵阀12；

所述第二泵阀11与第一反应池2之间的管道上设置有第四泵阀13；

所述第一泵阀10、第二泵阀11、第三泵阀12和第四泵阀13为三通泵阀。

优选的，所述双指标酶电极检测装置还包括管道a、管道b、管道c、管道d和管道e；

所述管道a位于第二泵阀11和第四泵阀13之间；

所述管道b位于第二泵阀11和第三泵阀12之间；

所述管道c、管道d和管道e通过三通阀连接；

所述管道c位于所述第四泵阀13和所述三通阀之间；

所述管道d位于所述第三泵阀12和所述三通阀之间；

所述管道e位于所述三通阀和所述废液瓶9之间。

本发明还提供了利用上述技术方案所述的双指标酶电极检测装置对生物反应器内底物和产物的在线测试方法，包括以下步骤：

在所述双指标酶电极检测装置中的反应池和管道内充满缓冲液；

将标准液依次通过第二反应池2和第一反应池1，分别记录产物酶电极响应信号值为b1和底物电极响应信号值为a1；

将标准液依次通过第一反应池1和第二反应池2，分别记录产物酶电极相应响应信号值为b2和底物电极响应信号值为a2；

发酵初期，将待测液依次通过第二反应池2和第一反应池1，分别记录底物酶电极3响应信号值为ax1和产物酶电极4响应信号值为bx1；所述发酵初期为发酵起始时间至bx的浓度范围为小于等于100mg/dl；

所述待测液中产物的测定结果为：bx＝bx1/b1×100mg/dl；

所述待测液中底物的测定结果为：ax＝ax1/a1×100mg/dl；

随着发酵进行，当bx的浓度范围为大于100mg/dl且ax的浓度范围为大于100mg/dl时，将所述待测液先依次通过第二反应池2和第一反应池1，分别记录底物酶电极3响应信号值为ax21和产物酶电极4响应信号值为bx21；然后再依次通过第一反应池1和第二反应池2，分别记录底物酶电极3响应信号值为ax22和产物酶电极4响应信号值为bx22；

所述待测液中产物的测定结果为：bx＝bx22/b2×100mg/dl；

所述待测液中底物的测定结果为：ax＝ax21/a1×100mg/dl；

当bx的浓度范围为大于100mg/dl且ax的浓度范围为小于等于100mg/dl时，将待测液依次通过第一反应池1和第二反应池2，分别记录底物酶电极3响应信号值为ax3和产物酶电极4响应信号值为bx3；

所述待测液中产物的测定结果为：bx＝bx3/b2×100mg/dl；

所述待测液中底物的测定结果为：ax＝ax3/a2×100mg/dl；

其中，bx为消除系统误差后待测液中产物酶电极的响应信号值，ax为消除系统误差后待测液中产物酶电极的响应信号值；x为测试的时间点。

优选的，所述缓冲液为ph＝7.0、浓度为0.2mol/l的磷酸缓冲液。

本发明提供了一种双指标酶电极检测装置，包括反应池、底物酶电极3、产物酶电极4、缓冲液瓶6、标准液瓶7和样品液瓶8，所述反应池包括通过管道串联的第一反应池1和第二反应池2；所述第一反应池1内设置底物酶电极3，第二反应池2内设置产物酶电极4；所述缓冲液瓶6、标准液瓶7和样品液瓶8通过管道汇总后，再分别与第一反应池1和第二反应池2通过管道连接。本发明将底物酶电极3和产物酶电极4分别安装在两个反应池内，两个反应池由管道联通，形成串联结构，开始测定时，待测样首先注入设置有产物酶电极4的第二反应池2内。待发酵过程产物浓度增加和底物浓度降低到一定浓度时，转换被测样品的检测顺序，即被测样品首先注入设置有底物酶电极3的第一反应池内。这样，低浓度的样品不需要经过提前进行稀释就可以在电极响应的线性范围内直接测定，避免了样品前处理(稀释)产生的误差，提高检测的精确度。而高浓度的样品经过两个反应池的稀释，即在测试过程中进行稀释，增加了样品在检测系统内的自动“稀释”功能，由于该稀释产生的误差能够通过标准溶液进行标定来消除，所以，使得最终的测试结果更加简单，方便的同时，还提高了检测的精确度。

附图说明

图1为本发明所述双指标酶电极检测装置的装置结构示意图，其中，1-第一反应池，2-第二反应池，3-底物酶电极，4-产物酶电极，5-搅拌子，6-缓冲液瓶，7-标准液瓶，8-样品液瓶，9-废液瓶，10-第一泵阀，11-第二泵阀，12-第三泵阀，13-第四泵阀；

图2为现有检测采用酶电极双指标在线检测的装置结构示意图，其中，14-反应池模块，15-反应池腔，16-酶膜的“o”型圈，17-进样和废液流出通道，18-反应池顶帽，19-进样帽，20-进样光传感器，21-酶电极，22-酶电极旋钮，23-缓冲液进口和废液排空管，24-废液析出管，25-电磁搅拌子，26-电极导线。

具体实施方式

本发明提供了一种双指标酶电极检测装置，包括反应池、底物酶电极3、产物酶电极4、缓冲液瓶6、标准液瓶7和样品液瓶8，所述反应池包括通过管道串联的第一反应池1和第二反应池2；

所述第一反应池1内设置底物酶电极3，第二反应池2内设置产物酶电极4；

所述缓冲液瓶6、标准液瓶7和样品液瓶8通过管道汇总后，再分别与第一反应池1和第二反应池2通过管道连接。

在本发明的一个具体实施例中，所述双指标酶电极检测装置还包括废液瓶9。

在本发明的一个具体实施例中，所述第一反应池1和第二反应池2内均设置有搅拌子5。在本发明中，所述搅拌子5可以使整个检测过程在搅拌的条件下进行，并使待测液在进入第一反应池或第二反应池时与里边的缓冲液快速并充分的混合。

在本发明的一个具体实施例中，所述缓冲液瓶6和标准液瓶7的管路汇总处设置有第一泵阀10；

所述标准液瓶7和样品液瓶8的管路汇总处设置有第二泵阀11；

所述第二泵阀11与第二反应池2之间的管道上设置有第三泵阀12；

所述第二泵阀11与第一反应池2之间的管道上设置有第四泵阀13；

所述第一泵阀10、第二泵阀11、第三泵阀12和第四泵阀13为三通泵阀。

在本发明的一个具体实施例中，所述双指标酶电极检测装置还包括管道a、管道b、管道c、管道d和管道e；

所述管道a位于第二泵阀11和第四泵阀13之间；

所述管道b位于第二泵阀11和第三泵阀12之间；

所述管道c、管道d和管道e通过三通阀连接；

所述管道c位于所述第四泵阀13和所述三通阀之间；

所述管道d位于所述第三泵阀12和所述三通阀之间；

所述管道e位于所述三通阀和所述废液瓶9之间。

在本发明中，上述管道a、管道b、管道c、管道d、管道e、第一泵阀10、第二泵阀11、第三泵阀12和第四泵阀13的设置可以保证所述双指标酶电极检测装置分为两个路径：其中，路径1为第二泵阀11、管道b、第二反应池2、第一反应池1、管道c、管道e和废液瓶9；路径2为第二泵阀11、管道a、第一反应池1、第二反应池2、管道d、管道e和废液瓶9。

本发明还提供了上述技术方案所述的双指标酶电极检测装置实现生物反应器底物和产物的在线测试方法，包括以下步骤：

在所述双指标酶电极检测装置中的反应池和管道内充满缓冲液；

将标准液依次通过第二反应池2和第一反应池1，分别记录产物酶电极响应信号值为b1和底物电极响应信号值为a1；

将标准液依次通过第一反应池1和第二反应池2，分别记录产物酶电极相应响应信号值为b2和底物电极响应信号值为a2；

发酵初期，将待测液依次通过第二反应池2和第一反应池1，分别记录底物酶电极3响应信号值为ax1和产物酶电极4响应信号值为bx1；所述发酵初期为发酵起始时间至bx的浓度范围为小于等于100mg/dl；

所述待测液中产物的测定结果为：bx＝bx1/b1×100mg/dl；

所述待测液中底物的测定结果为：ax＝ax1/a1×100mg/dl；

随着发酵进行，当bx的浓度范围为大于100mg/dl且ax的浓度范围为大于100mg/dl时，将所述待测液先依次通过第二反应池2和第一反应池1，分别记录底物酶电极3响应信号值为ax21和产物酶电极4响应信号值为bx21；然后再依次通过第一反应池1和第二反应池2，分别记录底物酶电极3响应信号值为ax22和产物酶电极4响应信号值为bx22；

所述待测液中产物的测定结果为：bx＝bx22/b2×100mg/dl；

所述待测液中底物的测定结果为：ax＝ax21/a1×100mg/dl；

当bx的浓度范围为大于100mg/dl且ax的浓度范围为小于等于100mg/dl时，将待测液依次通过第一反应池1和第二反应池2，分别记录底物酶电极3响应信号值为ax3和产物酶电极4响应信号值为bx3；

所述待测液中产物的测定结果为：bx＝bx3/b2×100mg/dl；

所述待测液中底物的测定结果为：ax＝ax3/a2×100mg/dl；

其中，bx为消除系统误差后待测液中产物酶电极的响应信号值，ax为消除系统误差后待测液中产物酶电极的响应信号值；x为测试的时间点。

本发明在所述双指标酶电极检测装置内充满缓冲液。进行测试前，本发明优选先将所述双指标酶电极检测装置替换掉sba-40生物传感分析仪中的双指标双指标酶电极检测装置。在本发明中，所述缓冲液优选为ph＝7.0、浓度为0.2mol/l的磷酸缓冲液。在所述双指标酶电极检测装置内充满缓冲液优选为将所述缓冲液分别通过路径1和路径2，将管道和反应池内充满缓冲液。在本发明中，所述标准液优选为100mg/dl产物-100mg/dl底物混合标准液。

下面结合实施例对本发明提供的双指标酶电极检测装置和实现生物反应器底物和产物的在线测试方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

仪器：sba-40生物传感分析仪，将其中的双指标双指标酶电极检测装置替换为本发明所述的双指标酶电极检测装置，所述双指标酶电极检测装置的结构如图1所示；

试剂：1)标准液：100mg/dl谷氨酸-100mg/dl葡萄糖混合标准液；

2)已知浓度的待测液：5mg/dl谷氨酸-1000mg/dl葡萄糖混合液；

3)缓冲剂：0.2m磷酸缓冲液，ph＝7.0；

4)电极：底物酶电极：固定化葡萄糖氧化酶电极(在电极头上滴上缓冲液，将葡萄糖氧化酶膜压放在电极头表面)；

产物酶电极：固定化谷氨酸氧化酶电极(在电极头上滴上缓冲液，将谷氨酸氧化酶膜压放在电极头表面)；

检测过程：

接通电源；

打开仪器开关，仪器自动进入清洗程序，分别通过路径1和路径2在所述双指标酶电极检测装置内充满缓冲液；

定标：将标准液依次通过第二反应池2和第一反应池1，分别记录产物酶电极响应信号值为b1＝8154和底物电极响应信号值为a1＝516；

将标准液依次通过第一反应池1和第二反应池2，分别记录产物酶电极相应响应信号值为b2＝534和底物电极响应信号值为a2＝8351；

样品测定：

将待测液依次通过第二反应池2和第一反应池1，产物酶电极响应信号值为bx1＝412和底物酶电极3响应信号值为ax1＝5173；

所述待测液中产物(谷氨酸)的测定结果为：bx＝bx1/b1×100＝412/8154×100＝5.05mg/dl；

所述待测液中底物(葡萄糖)的测定结果为：ax＝ax1/a1×100＝5173/516×100＝1002.52mg/dl。

实施例2

仪器：sba-40生物传感分析仪，将其中的双指标双指标酶电极检测装置替换为本发明所述的双指标酶电极检测装置，所述双指标酶电极检测装置的结构如图1所示；

试剂：1)标准液：100mg/dl谷氨酸-100mg/dl葡萄糖混合标准液；

2)已知浓度的待测液：150mg/dl谷氨酸-500mg/dl葡萄糖混合液；

3)缓冲剂：0.2m磷酸缓冲液，ph＝7.0；

4)电极：底物酶电极：固定化葡萄糖氧化酶电极(在电极头上滴上缓冲液，将葡萄糖氧化酶膜压放在电极头表面)；

产物酶电极：固定化谷氨酸氧化酶电极(在电极头上滴上缓冲液，将谷氨酸氧化酶膜压放在电极头表面)；

检测过程：

接通电源；

打开仪器开关，仪器自动进入清洗程序，分别通过路径1和路径2在所述双指标酶电极检测装置内充满缓冲液；

定标：将标准液依次通过第二反应池2和第一反应池1，分别记录产物酶电极响应信号值为b1＝8154和底物电极响应信号值为a1＝516；

将标准液依次通过第一反应池1和第二反应池2，分别记录产物酶电极相应响应信号值为b2＝534和底物电极响应信号值为a2＝8351；

样品测定：

将待测液依次通过第二反应池2和第一反应池1，产物酶电极响应信号值为bx21＝12254和底物酶电极3响应信号值为ax21＝25990；然后再依次通过第一反应池1和第二反应池2，产物酶电极响应信号值为bx22＝812和底物酶电极3响应信号值为ax21＝12571；

所述待测液中产物(谷氨酸)的测定结果为：bx＝bx22/b2×100＝812/534×100＝152.06mg/dl；

所述待测液中底物(葡萄糖)的测定结果为：ax＝ax21/a2×100＝25990/516×100＝502.42mg/dl。

实施例3

仪器：sba-40生物传感分析仪，将其中的双指标双指标酶电极检测装置替换为本发明所述的双指标酶电极检测装置，所述双指标酶电极检测装置的结构如图1所示；

试剂：1)标准液：100mg/dl谷氨酸-100mg/dl葡萄糖混合标准液；

2)已知浓度的待测液：200mg/dl谷氨酸-50mg/dl葡萄糖混合液；

3)缓冲剂：0.2m磷酸缓冲液，ph＝7.0；

4)电极：底物酶电极：固定化葡萄糖氧化酶电极(在电极头上滴上缓冲液，将葡萄糖氧化酶膜压放在电极头表面)；

产物酶电极：固定化谷氨酸氧化酶电极(在电极头上滴上缓冲液，将谷氨酸氧化酶膜压放在电极头表面)；

检测过程：

接通电源；

打开仪器开关，仪器自动进入清洗程序，分别通过路径1和路径2在所述双指标酶电极检测装置内充满缓冲液；

定标：将标准液依次通过第二反应池2和第一反应池1，分别记录产物酶电极响应信号值为b1＝8154和底物电极响应信号值为a1＝516；

将标准液依次通过第一反应池1和第二反应池2，分别记录产物酶电极相应响应信号值为b2＝534和底物电极响应信号值为a2＝8351；

样品测定：

将待测液依次通过第一反应池1和第二反应池2，产物酶电极响应信号值为bx3＝1062和底物酶电极3响应信号值为ax3＝4166；

所述待测液中产物(谷氨酸)的测定结果为：bx＝bx3/b2×100＝1062/534×100＝198.88mg/dl；

所述待测液中底物(葡萄糖)的测定结果为：ax＝ax3/a2×100＝4166/8351×100＝49.89mg/dl。

由此可见，利用本发明所述的双指标酶电极检测装置测试的结果精确度较高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。