一种果蔬中苦参碱农药残留量的高效液相色谱检测方法与流程

1.本发明属于食品污染物检测技术领域，特别涉及一种果蔬中苦参碱农药残留量的高效液相色谱检测方法。


背景技术：

2.苦参碱是豆科植物苦参的干燥根、植株、果实经乙醇等有机溶剂提取制成，是一种生物碱，在农业上是低毒、环保型农药，具有杀虫、杀菌活性和调节植物生长等多种功能对病虫害的防治和植物生长调节有较好作用，因此其作为一种新兴植物源性农药的有效成分被广泛应用于作物的种植栽培过程中。农药不仅会附着在农作物上，还会进入土壤、大气和水体中，而灌溉和降水又将土壤和大气中的残留药物带入水体中容易被动植物富集，并可通过食物链的传递危及人类健康。苦参碱用于水果、蔬菜病害的防治效果良好，但至今gb2763
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2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中目前尚无苦参碱在水果蔬菜中的检测方法标准，文献中大多是针对中药、烟草的检测，没有涉及果蔬产品。但苦参碱超范围使用、超限量添加现象却存在。发达国家已通过农药限量对中国的蔬菜、水果和水产品实施贸易技术壁垒。目前国际上适用用苦参碱的检测主要是液相色谱串联质谱、气相色谱串联质谱苦参碱的残留量，检测方法中前处理步骤比较繁琐，检验耗时较长，且需要购买价格昂贵的设备，所消耗的试剂量也较大。除此之外果蔬产品含有较多色素和有机酸，会对目标峰的确认有不同程度的干扰，需采用固相萃取方式对样品提取净化，减少干扰。
3.因此，建立固相萃取
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高效液相色谱法快速测定果蔬中苦参碱含量的检测方法，可利于对果蔬中苦参碱大批量检测的操作，大大改善了样品的分析效率，降低了检测难度，提高样品检测的准确性，更好的对果蔬质量安全有效监督。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供一种果蔬中苦参碱农药残留量的高效液相色谱检测方法，不但降低成本还减少干扰，保证检测准确度，具体方法如下：
5.一种果蔬中苦参碱农药残留量的高效液相色谱检测方法，包括如下步骤：采用乙腈和水体积比9:1的溶液提取待测样品中的苦参碱，得到的提取液经强阳离子交换萃取柱净化提取复溶得到样品溶液；具体步骤如下：准确称取待测样品20g精确到0.001g，置于离心管中，准确加入乙腈和水体积比9:1的溶液50ml，设置250
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400次/min的频率剧烈振摇10
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15min，静置后放入离心机，3000r/min离心5min取上清液后，残渣继续用25ml乙腈和水体积比9:1的溶液提取，合并滤液于100ml容量瓶，加入1.0mol/l盐酸4ml，用乙腈和水体积比9:1的溶液定容，取出5ml滤液待净化；用5％氨化甲醇溶液活化强阳离子交换萃取柱，依次用甲醇和水预淋洗，5ml滤液全部过柱后，依次用水和甲醇淋洗强阳离子交换萃取柱，抽干；用5％氨化甲醇溶液洗脱萃取柱两次，洗脱液在40℃下氮气吹干，加入1.00ml流动相，涡旋30s，过0.22μm有机系滤膜供仪器测定；
6.配制苦参碱的标准溶液，按照浓度梯度配制多份标准系列溶液；
7.采用高效液相色谱法对所述样品溶液和标准品溶液进行检测分析，利用外标法得到苦参碱的含量。
8.优选的，标准系列溶液的配制包括如下步骤：精密称取适量苦参碱标准品，用甲醇溶解稀释并转移至容量瓶并定容，配制成适当浓度的苦参碱标准储备液，分别吸取适量储备液，用流动相配制成浓度0.1ug/ml，0.3ug/ml，0.5ug/ml，1.0ug/ml，5.0ug/ml，10.0ug/ml系列标准工作液。
9.优选的，高效液相色谱检测分析包括如下步骤：将标准工作液与样品工作液分别注入到高效液相色谱仪中，进行高效液相色谱分析，以标准工作液的峰面积与样品工作液峰面积进行定量比较，保留时间定性，外标法进行计算，计算样品中苦参碱的含量；所述高效液相色谱法的色谱条件为：
10.色谱柱：c
18
色谱柱，规格为柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm；柱温：30
±
5℃；
11.进样量：10μl；流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为甲醇，所述流动相b为ph＝9，5％磷酸氢二钠水溶液，二者体积比为a:b＝40:60；流速：1.0ml/min；检测波长：波长设置为215nm。
12.苦参碱属于水溶性农药，在碱性溶液中的溶解度较大。本试验比较了甲醇、水
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甲醇、乙腈、氨水
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乙腈、乙腈
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水等不同种类和混合比例的提取液。使用甲醇、水
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甲醇提取，回收率不高；用乙腈提取有机相中杂质减少，但水相中残留一定量的苦参碱，致使其回收率低；使用氨水
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乙腈不同比例的提取液，发现氨水
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乙腈对个别蔬菜的回收率不太稳定；使用乙腈
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水不同比例的提取液，当乙腈
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水的体积比为9∶1时，乙腈的极性较强，能有效沉淀蛋白等成分，减少干扰，有机相苦参碱提取率高，既保证了苦参碱的高溶解度，又达到了较好的提取效果，回收率高且稳定。因此，确定用乙腈
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水9:1混合溶液分两次充分提取，保证苦参碱完全提取。
13.由于果蔬样品含有较多色素，脂肪酸、糖类果酸等物质，会对目标峰有干扰，本专利选取bond elut plexa pcx强阳离子交换萃取柱对苦参碱萃取效果较好，能够吸附有机酸、果酸与色素等物质，提取液干扰杂质较少，萃取效果好，样品回收率较高。样品提取液中加入4ml1.0mol/l盐酸，将提取液的ph值控制在2
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4，以保证其带足够的电荷，在洗脱前全部保留在小柱上；在上样前先用5％氨化甲醇溶液充分活化强阳离子交换萃取柱，能够使苦参碱有效吸附在小柱上，上述做法都能有效提高回收率至80％以上。
14.所述高效液相色谱法采用等度洗脱。采用该比例流动相，峰形较好，平衡时间最短，可以排除来自其他成分的干扰，目标组分可与样品中其他组分较好的分离。
15.通过方法学考察，苦参碱进样量在0.10～10.0μg/ml范围内，与峰面积呈良好的线性关系(y(面积)＝107.2x(浓度)
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1.02)，相关系数均大于0.9996。检出限为0.1mg/kg。
16.本发明的有益效果是：
17.1、本发明的果蔬中苦参碱农药残留量的高效液相色谱检测方法，采用高效液相色谱法的分析方法能够更有针对性，更快速有效地对果蔬中苦参碱农药残留量进行准确的分析检测，使得成分检测分析更快速，节省时间。
18.2、本发明的果蔬中苦参碱农药残留量的高效液相色谱检测方法，获得的苦参碱的峰形和分离度都很好，且线性很好，可以有效的与基质中其他杂质获得有效分离，避免其他物质的干扰，检测提取更为精确。
19.3、本发明的前处理方法过程简单，提取效率高，前处理使用spe小柱适用范围广，净化效果好，采用试剂对人和环境较友好。方法的回收率、精密度、检出限在方法要求的范围内，在实际样品测定也能满足实验要求，其相对偏差均在标准要求范围内，能够满足日常检验。
附图说明
20.图1添加水平1.0mg/kg土豆中苦参碱检测的液相色谱图
21.具体实施方法
22.下面结合实施例更好地阐明本发明而不限制本发明。
23.我们的试剂和仪器
24.试剂甲醇：色谱；磷酸氢二钠：分析级；盐酸；氨水；5％氨化甲醇溶液：取5氨水，慢慢加入到100ml甲醇溶液中，混匀。
25.仪器：agilent 1260安捷伦高效液相色谱仪(紫外检测器)
26.实施例1
27.一种黄瓜中苦参碱农药残留量的高效液相色谱检测方法，包括如下步骤：
28.(1)采用乙腈和水体积比9:1的溶液提取待测样品中的苦参碱，得到的提取液经强阳离子交换萃取柱净化提取复溶得到样品溶液；具体步骤如下：准确称取待测样品20g，置于离心管中，准确加入乙腈和水体积比9:1的溶液50ml，设置250次/min的频率剧烈振摇15min，静置后放入离心机，3000r/min离心5min取上清液，残渣继续用25ml乙腈和水体积比9:1的溶液提取，合并滤液于100ml容量瓶，加入1.0mol/l盐酸4ml，用乙腈和水体积比9:1的溶液定容，取出5ml滤液待净化；用5％氨化甲醇溶液活化强阳离子交换萃取柱，依次用甲醇和水预淋洗，5ml滤液全部过柱后，依次用水和甲醇淋洗强阳离子交换萃取柱，抽干；用5％氨化甲醇溶液洗脱萃取柱两次，洗脱液在40℃下氮气吹干，加入1.00ml流动相，涡旋30s，过0.22μm有机系滤膜供仪器测定；
29.(2)配制苦参碱的标准溶液，按照浓度梯度配制多份标准系列溶液；精密称取适量苦参碱标准品，用甲醇溶解稀释并转移至容量瓶并定容，配制成适当浓度的苦参碱标准储备液，分别吸取适量储备液，用流动相配制成浓度0.1ug/ml，0.3ug/ml，0.5ug/ml，1.0ug/ml，5.0ug/ml，10.0ug/ml系列标准工作液。
30.(3)采用高效液相色谱法对所述样品溶液和标准品溶液进行检测分析，利用外标法得到苦参碱的含量，将标准工作液与样品工作液分别注入到高效液相色谱仪中，进行高效液相色谱分析，以标准工作液的峰面积与样品工作液峰面积进行定量比较，保留时间定性，外标法进行计算，计算样品中苦参碱的含量；其特征在于，所述高效液相色谱法的色谱条件为：
31.色谱柱：c18色谱柱，规格为柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm；柱温：30
±
5℃；
32.进样量：10μl；流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为甲醇，所述流动相b为ph＝9，5％磷酸氢二钠水溶液，二者体积比为a:b＝40:60；流速：1.0ml/min；检测波长：波长设置为215nm。
33.实施例2
34.一种土豆中苦参碱农药残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于，包括如下
步骤：
35.(1)采用乙腈和水体积比9:1的溶液提取待测样品中的苦参碱，得到的提取液经强阳离子交换萃取柱净化提取复溶得到样品溶液；具体步骤如下：准确称取待测样品20g，置于离心管中，准确加入乙腈和水体积比9:1的溶液50ml，设置300次/min的频率剧烈振摇12min，静置后放入离心机，3000r/min离心5min取上清液后，残渣继续用25ml乙腈和水体积比9:1的溶液提取，合并滤液于100ml容量瓶，加入1.0mol/l盐酸4ml，用乙腈和水体积比9:1的溶液定容，取出5ml滤液待净化；用5％氨化甲醇溶液活化强阳离子交换萃取柱，依次用甲醇和水预淋洗，5ml滤液全部过柱后，依次用水和甲醇淋洗强阳离子交换萃取柱，抽干；用5％氨化甲醇溶液洗脱萃取柱两次，洗脱液在40℃下氮气吹干，加入1.00ml流动相，涡旋30s，过0.22μm有机系滤膜供仪器测定；
36.(2)配制苦参碱的标准溶液，按照浓度梯度配制多份标准系列溶液；精密称取适量苦参碱标准品，用甲醇溶解稀释并转移至容量瓶并定容，配制成适当浓度的苦参碱标准储备液，分别吸取适量储备液，用流动相配制成浓度0.1ug/ml，0.3ug/ml，0.5ug/ml，1.0ug/ml，5.0ug/ml，10.0ug/ml系列标准工作液。
37.(3)采用高效液相色谱法对所述样品溶液和标准品溶液进行检测分析，利用外标法得到苦参碱的含量，高效液相色谱检测分析包括如下步骤：将标准工作液与样品工作液分别注入到高效液相色谱仪中，进行高效液相色谱分析，以标准工作液的峰面积与样品工作液峰面积进行定量比较，保留时间定性，外标法进行计算，计算样品中苦参碱的含量；其特征在于，所述高效液相色谱法的色谱条件为：
38.色谱柱：c18色谱柱，规格为柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm；柱温：30
±
5℃；
39.进样量：10μl；流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为甲醇，所述流动相b为ph＝9，5％磷酸氢二钠水溶液，二者体积比为a:b＝40:60；流速：1.0ml/min；检测波长：波长设置为215nm。
40.实施例3
41.一种白菜中苦参碱农药残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
42.(1)采用乙腈和水体积比9:1的溶液提取待测样品中的苦参碱，得到的提取液经强阳离子交换萃取柱净化提取复溶得到样品溶液；具体步骤如下：准确称取待测样品20g，置于离心管中，准确加入乙腈和水体积比9:1的溶液50ml，设置400次/min的频率剧烈振摇10min，静置后放入离心机，3000r/min离心5min取上清液，残渣继续用25ml乙腈和水体积比9:1的溶液提取，合并滤液于100ml容量瓶，加入1.0mol/l盐酸4ml，用乙腈和水体积比9:1的溶液定容，取出5ml滤液待净化；用5％氨化甲醇溶液活化强阳离子交换萃取柱，依次用甲醇和水预淋洗，5ml滤液全部过柱后，依次用水和甲醇淋洗强阳离子交换萃取柱，抽干；用5％氨化甲醇溶液洗脱萃取柱两次，洗脱液在40℃下氮气吹干，加入1.00ml流动相，涡旋30s，过0.22μm有机系滤膜供仪器测定
43.2)配制苦参碱的标准溶液，按照浓度梯度配制多份标准系列溶液；精密称取适量苦参碱标准品，用甲醇溶解稀释并转移至容量瓶并定容，配制成适当浓度的苦参碱标准储备液，分别吸取适量储备液，用流动相配制成浓度0.1ug/ml，0.3ug/ml，0.5ug/ml，1.0ug/ml，5.0ug/ml，10.0ug/ml系列标准工作液。
44.(3)采用高效液相色谱法对所述样品溶液和标准品溶液进行检测分析，利用外标法得到苦参碱的含量，高效液相色谱检测分析包括如下步骤：将标准工作液与样品工作液分别注入到高效液相色谱仪中，进行高效液相色谱分析，以标准工作液的峰面积与样品工作液峰面积进行定量比较，保留时间定性，外标法进行计算，计算样品中苦参碱的含量；其特征在于，所述高效液相色谱法的色谱条件为：
45.色谱柱：c18色谱柱，规格为柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm；柱温：30
±
5℃；
46.进样量：10μl；流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为甲醇，所述流动相b为ph＝9，5％磷酸氢二钠水溶液，二者体积比为a:b＝40:60；流速：1.0ml/min；检测波长：波长设置为215nm。
47.实施例4
48.一种苹果中苦参碱农药残留量的高效液相色谱检测方法，包括如下步骤：
49.(1)采用乙腈和水体积比9:1的溶液提取待测苹果中的苦参碱，得到的提取液经强阳离子交换萃取柱净化提取复溶得到样品溶液；具体步骤如下：准确称取苹果20g，置于离心管中，准确加入乙腈和水体积比9:1的溶液50ml，设置300次/min的频率剧烈振摇12min，静置后放入离心机，3000r/min离心5min取上清液后，残渣继续用25ml乙腈和水体积比9:1的溶液提取，合并滤液于100ml容量瓶，加入1.0mol/l盐酸4ml，用乙腈和水体积比9:1的溶液定容，取出5ml滤液待净化；用5％氨化甲醇溶液活化强阳离子交换萃取柱，依次用甲醇和水预淋洗，5ml滤液全部过柱后，依次用水和甲醇淋洗强阳离子交换萃取柱，抽干；用5％氨化甲醇溶液洗脱萃取柱两次，洗脱液在40℃下氮气吹干，加入1.00ml流动相，涡旋30s，过0.22μm有机系滤膜供仪器测定；
50.(2)配制苦参碱的标准溶液，按照浓度梯度配制多份标准系列溶液；精密称取适量苦参碱标准品，用甲醇溶解稀释并转移至容量瓶并定容，配制成适当浓度的苦参碱标准储备液，分别吸取适量储备液，用流动相配制成浓度0.1ug/ml，0.3ug/ml，0.5ug/ml，1.0ug/ml，5.0ug/ml，10.0ug/ml系列标准工作液。
51.(3)采用高效液相色谱法对所述样品溶液和标准品溶液进行检测分析，利用外标法得到苦参碱的含量，高效液相色谱检测分析包括如下步骤：将标准工作液与样品工作液分别注入到高效液相色谱仪中，进行高效液相色谱分析，以标准工作液的峰面积与样品工作液峰面积进行定量比较，保留时间定性，外标法进行计算，计算样品中苦参碱的含量；其特征在于，所述高效液相色谱法的色谱条件为：
52.色谱柱：c18色谱柱，规格为柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm；柱温：30
±
5℃；
53.进样量：10μl；流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为甲醇，所述流动相b为ph＝9，5％磷酸氢二钠水溶液，二者体积比为a:b＝40:60；流速：1.0ml/min；检测波长：波长设置为215nm。
54.表1四种样品苦参碱回收率及精密度结果
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由上表可以看出用本发明的方法检测黄瓜、土豆、白菜、苹果四种产品中的苦参碱，相对偏差小于9.8％，回收率大于80％。由此可以看出本发明的固相萃取
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高效液相色谱法检测果蔬中的苦参碱前处理方法简单易操作，提取效率高，净化效果好，检测精度高，检测灵敏，检测时间较短，检测效率高。由图1可以看出使用高效液相色谱检测土豆中添加量1.0mg/kg苦参碱的液相色谱图在10.983min出现目标峰，检测方便，快捷。