一种石斛生物碱类成分的高效液相色谱指纹图谱构建方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种石斛生物碱类成分指纹图谱测定方法，是通过恒温水浴回流萃取技术，利用氨水浸渍石斛粉末，再经氯仿萃取，过滤浓缩干燥得石斛总生物碱粗品，粗品用甲醇溶解得储备液用于高效液相色谱分析，得到石斛生物碱类指纹图谱。本发明优点：所得色谱指纹图谱能较全面反映石斛所含生物碱类成分，体现石斛生物碱类的复杂性，能为不同品种石斛鉴别提供科学依据；所建立的HPLC指纹图谱具有较大的稳定性和重现性，该研究为石斛品种质量控制提供科学参考。
【专利说明】一种石斛生物碱类成分的高效液相色谱指纹图谱构建方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及石斛生物碱类成分高效液相色谱指纹图谱构建方法，属于生物制品和中药制备【技术领域】。
【背景技术】
[0002]生物碱是石斛中重要的药用成分之一，也是石斛属植物中最早分离并进行结构确认的化合物。一般认为，石斛生物碱的药理作用主要表现在抗肿瘤、对心血管、胃肠道抑制作用及止痛退热强神等作用。研究表明金钗石斛主要成分石斛碱具止痛解热作用，可降低心率、血压，减缓呼吸，可产生中度的高血糖，具强壮作用并可解巴比妥中毒。然而，不同石斛品种生物碱成分的组成和含量差异较大，王宪楷等对之前生物碱方面的研究进行了 总结，发现有 5 种石斛属植物(D.nobile, D.kildebrandii, D.friedricksianum,D.findlayanum, D.wardianum)中含石斛碱类生物碱,8种石斛属植物含其他类型且彼此无共同基核的生物碱，且石斛碱仅在(D.nobile,D.findlayanum)中发现。鉴于石斛生物碱成分研究的复杂性，急需开发一种快速高效的指纹图谱方法，用于不同石斛的鉴别和石斛药材质量评价。目前，国内外发表的文献中，仅采用显微鉴定，薄层色谱和高效液相色谱与气相色谱法及质谱对某种石斛中的某些特征成分进行研究，较缺少不同石斛生物碱类整体系统地研究和比较，显然，这种质量评价方法不能准确鉴别和评价石斛生物碱成分的质量。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种石斛生物碱类成分高效液相色谱指纹图谱的构建方法。本发明采用HPLC技术对不同石斛进行测定，建立生物碱的指纹图谱，为以后石斛生物碱类成分的科学研究提供一个快速分析和检测的方法和手段。
[0004]本发明解决技术问题采用如下技术方案:
[0005]一种石斛生物碱类成分的高效液相色谱指纹图谱构建方法，其特点在于，所述方法包括:
[0006]( I)材料收集
[0007]收集不同产地的不同品种石斛鲜苗
[0008](2)标准石斛样品溶液的制备:取步骤I)的各石斛鲜苗在105°C的烘箱中杀青15?20min，60°C烘箱中恒温烘干，粉碎，过60目筛，得样品粗粉，取样品粗粉0.5g，加入5ml氨水,润洗密塞30min,加入氯仿50ml称重,水浴65°C回流3h,冷却后，氯仿补足失重，得提取液；所述提取液旋转蒸发至干，加甲醇5ml溶解，用0.22 μ m微孔滤膜过滤，所得滤液作为标准石斛样品溶液；
[0009](2)色谱条件:色谱柱为C18反相色谱柱；流动相:乙腈和水梯度洗脱；体积流量:lml/min ;柱温:30°C ;检测波长:220nm ;进样量:5_10ul ;分析时间:62min ；
[0010]梯度洗脱程序如下[
【权利要求】
1.一种石斛生物碱类成分的高效液相色谱指纹图谱构建方法，其特征在于，所述方法包括: (1)材料收集 收集不同石斛品种，并培养组培苗 (2)标准石斛样品溶液的制备:取步骤I)的各石斛组培苗在105°C的烘箱中杀青15~20min，60°C烘箱中恒温烘干，粉碎，过60目筛，得样品粗粉，取样品粗粉0.5g，加入5ml氨水，润洗密塞30min，加入氯仿50ml称重，水浴65°C回流3h，冷却后，氯仿补足失重，得提取液；所述提取液旋转蒸发至干，加甲醇5ml溶解，用0.22 μ m微孔滤膜过滤，所得滤液作为标准石斛样品溶液； (2)色谱条件:色谱柱为C18反相色谱柱；流动相:乙腈和水梯度洗脱；体积流量:1ml/min ;柱温:30°C ;检测波长:220nm ;进样量:5_10ul ;分析时间:62min ； 梯度洗脱程序如下
时间(min)~j乙腈(％) I水(％)
O2080
508020
522080
62 20 80 所述流动相中加有终浓 度0.005%氨水； (3)石斛生物碱类成分指纹图谱的获得，将步骤I)所述的标准石斛样品溶液注入高效液相色谱分析仪中，按步骤2)所述的色谱条件进行测定，获得对应样品的标准指纹图谱。
2.权利要求1所述指纹图谱构建方法的应用，其特征在于:按权利要求1的方法构建待测石斛生物碱类成分的高效液相色谱指纹图谱，将所述指纹图谱与权利要求1中所获得的对应样品的标准指纹图谱进行对比，比较待测石斛与标准石斛样品的中的生物碱成分，从而快速鉴别待测石斛的品种及石斛生物碱成分的质量。
【文档编号】G01N30/02GK103604877SQ201310526400
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】林毅, 宋程, 金青, 蔡永萍, 钟伦锁, 孙时伟, 张玲 申请人:安徽农业大学