放射性免疫分析生物样品的方法

专利名称：放射性免疫分析生物样品的方法
专利说明 本发明涉及一种检测乙型肝炎表面抗原-抗体等生物活性分子样品的放射性免疫分析方法，它包括固相载体的包被，标记物的制备，非特异液地制备和自检标准的制备。
自从放射性免疫分析进入检测病毒和激素等生物活性分子领域之后，检测手段发生了根本的变化。如乙型肝炎的检测就得到了很大发展，灵敏度大大提高，特异性显著增强。特别是固相放射性免疫分析方法，使乙型肝炎的抗原检测灵敏度达到1ng/ml的水平。
但是，抗原-抗体的检测长期采取两个药盒分别进行。如乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎表面抗体(HBsAb)的检测采取两个药盒进行(如C.M.Ling等在J.Immanol，109，834(1972)上公开的)。检测HBsAg，采用固相载体上包被HBsAb，标记物为125I-HBsAb的药盒;相反，检测HBsAb，采用固相载体上包被HBsAg，标记物为125I-HBsAg的药盒。因此，两种指标的检测不能一次完成。要检测一个人的这两种指标，得重复操作，费时费力，血清用量多，很不经济。
因为，乙型肝炎表面抗原标志乙型肝炎病毒感染，乙型肝炎表面抗体标志患者克服了乙型肝炎病毒感染，获得了免疫力。所以两种指标各表示不同的临床意义，不论在流行病普查中，还是在临床检验上，两种指标都需要进行测定。因此后来发展为将两种药盒的组分组装在一个药盒内，参阅美国专利3867517和4012494。这样，对一个人的两种指标的测定，仍需要操作两次。与过去相比，操作次数、时间和血清用量没有改善，唯一的进步是两次操作可以同时开始。
还有一种方法，如美国专利3826619所公开的，可以一次把两种指标测出。它是把两种不同的包被物HBsAg和HBsAb分别包被在两个相匹配的管子和插头上。但是这种固相载体，制造加工和包被都有许多困难。
本发明的目的在于提供一种将抗原和抗体包被在一个固相载体上来实现通过一次检测，同时分析出抗原和抗体(双测)，如HBsAg和HBsAb两个指标的新方法。
实现上述目的的方案是在固相载体上包被有抗原和抗体，让固相载体与标本反应，然后检测固相载体与放射性标记物结合的程度，根据固相载体上的放射性强度大小，参照双阴性基准值。判定标本是抗原阳性，或是抗体阳性，或是两者均为阴性三种情况。
现在以同时检测HBsAg和HBsAg两个指标为例，将本发明的内容详细描述于下 固相载体上包被有HBsAg和HBsAb。这种固相载体与标本反应，若标本上有HBsAg，则固相载体与标记物125I-HBsAb结合能力增强，固相载体上的放射性强度大。若标本中有HBsAb，则固相载体与标记物125I-HBsAg结合能力减弱，固相载体上的放射性强度小。若标本为正常，即没有HBsAg和HBsAb，则固相载体上放射性强度中等水平。所以，只要根据固相载体上的放射性强度的大小，就可以判别出标本是HBsAg阳性，或HBsAb阳性或者两者均为阴性三种情况，达到区别三种人的目的。
本方法还可以将标记物125I-HBsAb换成125I-HBsAg。这样，固相载体上放射性大的是HBsAb阳性，而放射性小的是HBsAg阳性，放射性中等的仍是HBsAg和HBsAb均为阴性。
在放射免疫分析生物样品中，制备双测药盒，同时检测抗原和抗体具有临床意义，特别对同时检测HBsAg和HBsAb更有临床意义。对于地处乙型肝炎高发区的我国，成年人约不80%的人感染过乙型肝炎病毒(HBV)，其中90%的人自然转阴，少数(约10%)成为HBV携带者。在流行病调查中，迫切希望把乙型肝炎的传染源(HBsAg阳性)，未感染者(HBsAg阴性、HBsAb阴性)和感染过而获得免疫力者(HBsAb阳性)，三种人区别开来。而HBsAg和HBsAb是区别三种人的重要标志物。
在感染普遍存在的情况下，人们都希望知道自身的HBsAb存在情况，更多的人想获得这种免疫力-HBsAb。
部分乙型肝炎患者希望了解自己的予后情况。
乙型肝炎药物的筛选研究，要检测HBsAg和HBsAb这两种指标，观察药物的治疗效果。
对许多HBV携带者追踪随访，需要观察HBsAg和HBsAb的消长情况。
这些工作都需要频繁检测这两种指标，本发明正是为此应运而生。
根据本发明提供的方法，还可以制成甲型肝炎双检测药盒，乙型肝炎E抗原-抗体双检测药盒，D型肝炎双检测药盒，胰岛素和抗胰岛素双测定药盒。及凡由病毒引起，康复后产生抗体的各病毒的双检测药盒。
实施例1.HBsAg和HBsAb的双测 1.双测定药盒的制备 a.固相塑料小球的包被首先将固相载体-塑料小球经予处理，在磷酸缓冲液配制的包被液中，包被上HBsAg和HBsAb。包被过的塑料小球用封闭液封闭空位。然后将小球保存在磷酸缓冲液中，或者湿态保存在4℃，备组装药盒用; b.标记物125I-HBsAb的制备标记用抗体为高纯制品，标记方法为氯胺丁法。标记混合物的纯化用葡聚糖凝胶G50(Sephadex-G50)柱分离。纯分后加入保护剂和防腐剂。然后分装，冻干，密封，贮存备组装药盒用; c.非特异液的制备为求塑料小球对标记物125I-HBsAb的非特异吸附而设，即阻断塑料小球上的HBsAg与125I-HBsAb结合。
正常人血清加适量阻断剂。正好阻止正常的特异结合。
d.双阴性液的制备为求塑料小球的双阴性基准而设。用不含HBsAg和HBsAb的正常人血清配制而成。
e.药盒自检标准的制备为用户检验药盒质量而设，其中有HBsAg阳性对照，HBsAb阳性对照。均系病人的血清制成，即HBsAg阳性病人和HBsAb阳性病人血清配制而成，并含有防腐剂和保护剂。
2.实验 试验在圆底玻璃试管中进行，检测中温育采用水浴。
取φ10×80的圆底玻璃试管若干支，设置3管非特异管，3管双阴性管，2管HBsAg阳性对照管，2管HBsAb阳性对照管，其余的为标本管。
具体操作步骤 a.加样在3管非特异管中各加200μl非特异液，在3管双阴性管中各加100μl非特异液和100μl双阴性液，在2管HBsAg阳性对照管中各进100μl双阴性液和100μlHBsAg阳性对照液，在2管HBsAb阳性对照管中各加100μl双阴性液和100μlHBsAb阳性对照油，在各标本管中加100μl双阴性液和100μl标本。加毕后振荡2～3分钟; b.在每个试管中各加1粒包被的塑料小球，加后振荡3分钟; c.第一次温育在45℃水溶中进行2小时; d.第一次洗涤吸出反应残液后洗4次，每次用～1ml生理盐水洗涤。对标本管特别要求，在吸出反应残液后，要立即洗一次，然后才能取下一个标本管残液，总洗涤也是每管四次。
e.在每个试管中各加标记物200μl，加后振荡3分钟; f.第二次温育在45℃水浴中进行1～2小时; g.第二次洗涤吸出标记物后洗4次，每次用1ml生理盐水; h.擦球将洗涤完毕的塑料小球，每4～5粒倒在多层吸水纸折成的折缝中擦干，即可装入测量管测量放射性计数。
3.结果判定 设三个非特异管的平均每分钟的计数为b，3个双阴性管的平均每分钟计数为N，阳性对照管的平均每分钟计数为P，则自检结果从下列的表中可见双测定法不但灵敏度远比RPHA法要高，而且能检测出HBsAb阳性(1＃)和双阴性(3＃)。
对HBsAg阳性对照有P-B/N-b≥1.5 对HBsAb阳性对照有P-b/N-b≤0.5 此时药盒为正常，测定结果有效。
要求125I-放免仪的本底计数B0小于非特异计数b0。若B0和b0相当，则要延长计数时间。
标本管的每分钟计数视同P.则 P-b/N-b≥1.5判标本HBsAg阳性; P-b/N-b≤0.5判标本HBsAb阳性; 0.75＜P-b/N-b＜1.25判标本HBsAg和HBsAb均阴性。
本方法与反向被血凝法(RPHA)作了8份样品的比较，将比较结果列于下表
实施例2.乙型肝炎“E”抗原(HBeAg)-抗体(抗-HBe)双测定药盒的制备 1.标记物 125I-抗-HB的制备从125I标记抗-HBe而制得; 2.包被固相载体以HBeAg和抗-HBe包被固相载体; 3.双阴性标准由HBeAg和抗-HBe均阴性的血清制备，作为药盒测定的基准值; 4.HBeg阳性对照药盒的自检标准由病人HBeAg阳性血清制备; 5.抗-HBe阳性对照药盒的自检标准由病人HBeAb阳性血清制备。
药盒特性本药盒一次可以检测出HBeAg阳性，抗-HBe阳性，两种结果，对于区别乙型肝炎患者的传染性有重要意义。
如果病人血清中含有HBeAg，则固相表面吸收HBeAg，再与125I-抗-HBe反应，则固相表面带有大量的放射性，其数值显著大于双阴性值。相反，则固相表面不带或很少带放射性，其值显著地小于双阴性值。可以把HBeAg阳性，抗-HBe阳性的人清楚地区分开。
实施例3.胰岛素及其抗体的双测定药盒的制备。
胰岛素(INS)是调节机体糖代谢的激素。正常人体有固定的水平。分泌不足将发生糖尿病。但一部分患者中，同时患有自身免疫病，其血清中，INS测不到，而血清中反而存在有大量的胰岛素抗体(抗-INS)。这种情况下，胰岛素测定药盒，只能报出，INS含量低下不能正确判定结果，造成误判、误治，给患者带来灾难。
双测药盒正是在这种情况下诞生的。它可正确报出INS含量，而且可以正确报出抗-INS的含量。
药盒各组分的制备。
1.标记物 I-抗-INS，用125I标记抗-INS制得。
2.固相载体的包被 固相载体表面包被INS和抗-INS。
3.基准值(双阴性液) 用不含INS和抗-DNS的正常人血清制备，本品为药盒的测定基准。
4.INS标准6瓶，分别为6个不同浓度点，作标准曲线用。正常值可由曲线给出。
5.抗-INS标准6瓶，分别为6个不同滴度。
检测方法当患者血清中含有INS，则固相表面吸附大量的INS，再与125I-抗-INS反应，则固相表面上吸附大量125I-抗-INS，放射性很大，其值远高于基准值，可在INS标准曲线上查出含量，判定患者是否正常。当患者血清中含有抗-INS，则固相表面带有很少或不带放射性，其值显著小于基准值。这就把患有自身免疫病的患者清楚的分别出来，避免了胰岛素测定药盒的缺点。
权利要求
1、一种放射性免疫分析生物样品的方法，包括固相载体的包被，标记物的制备，非特异液的制备和自检标准的制备，本发明的特征在于固相载体上包被有抗原和抗体，其固相载体与标本反应后，检测其固相载体与放射性标记物结合的程度，据此参照双阴性基准值，判定标本为抗原阳性，或抗体阴性，或双阴性三种情况，并制备有双阴性液。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的固相载体为塑料小球。
3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于固相载体上包被有HBs Ag和HBsAb，其标记物为I-HBsAb或I-HBsAg，双阴性液由HBsAg和HBsAb均为阴性的血清制备。
4、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于固相载体上色被有HBeAg和抗-HBe，其标记物为以I-标记抗-HBe，其双阴性液由HBeAg和抗-HBe均为阴性的血清制备。
5、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于固相载体上包被有INS和抗-INS，其标记物由I标记抗-INS制得，其双阴性液由不含INS和抗-INS的血清制备。
全文摘要
一种检测生物活性物质抗原-抗体活性分子的放射性免疫分析方法。在固相载体上包被有抗原和抗体，让固相载体与标本反应，然后检测固相载体与放射性标记物结合的程度。据此，判定标本为抗原阳性，或抗体阳性，或双阴性三种情况。应用本方法可制成乙型肝炎表面抗原-抗体双检测药盒，乙型肝炎E抗原-抗体双检测药盒，甲型肝炎病毒-抗体双检测药盒，D型肝炎病毒-抗体双检测药盒，胰岛素和抗胰岛素双测定药盒。及凡由病毒引起，康复后产生抗体的各病症的双检药盒。
文档编号G01N33/576GK1041041SQ8810642
公开日1990年4月4日 申请日期1988年9月9日 优先权日1988年9月9日
发明者杨树斌 申请人:中国原子能科学研究院