专利名称：植物保护方法
技术领域：
本发明涉及一种保护植物抵抗病原的方法。
更具体的，本发明涉及一种新的信号转导途径，它导致了能够保护植物免受这种病原侵害的蛋白质的表达。
更具体的说，本发明涉及一种保护植物抵抗病原如真菌和细菌的方法。
众所周知，受微生物病原侵害的植物能诱导一组编码致病相关蛋白(PR蛋白质)之防御相关基因的表达。这些蛋白质不但可以在受病原侵害部位被检测到而且还可在未受侵染的叶片中检测到，并且它们产生整体获得性抵抗力-即植物对微生物病原再次侵入表现增强的抵抗力的一种状态。还知道，当微生物病原感染叶片引起内源性水杨酸水平增加并随后诱导PR蛋白质时，水杨酸(SA)在导致整体获得的抵抗力的信号转导途径中起重要作用。
本发明涉及另一种信号转导途径，激活该途径同样表现出诱导对病原，特别是微生物病原的抵抗力并且该途径可有水杨酸途径之外的用途，或代替水杨酸途径的用途。
先前的工作已经证实在马铃薯和西红柿植株外源应用茉莉酸酯(jasmonate)和甲基茉莉酸酯诱导对晚疫病真菌Phytophthorainfestans(Cohen等，1993)的抵抗力。然而没有通过诱导植物防御基因的表达来保护植物抵抗病原的说法。
用甲基茉莉酸酯进行治疗在两个其他的植物/病原体系，即大麦/Erysiphe graminis(Kogel等1995)或水稻/Magnaporthegisea(Schweizer等，1997)都没有提供抵抗力。
充分资料表明已知激活水杨酸依赖型病原诱导防御反应的化合物，如水杨酸本身，乙酰水杨酸，2,6-二氯异烟酸(INA)和1,2,3-苯并噻二唑-7-硫代羟酸S甲酯，可诱导对一定范围的微生物病原，包括病毒，细菌和真菌的抵抗力(White等，1979；Kessmann等，1994；Lawton等，1996；Friedrich等；Gorlach等)。有趣的是，1,2,3-苯并噻二唑-7-硫代羟酸S甲酯不能保护烟草植物抵抗死体营养的病原Botrytis cinerea和Alternaria alternata的侵染(Lawton等)。
先前业已鉴别出三个Arabidopsis基因，即PR-1,PR-2(β-1,3-葡聚糖酶)和PR-5(渗透素样蛋白(osmotin-like protein))，在受到病原感染时被协同而整体的诱导(Uknes等，1993；Dempsey等，1993；Mauch-Mani和Slusarenko,1994)。这些基因都可在外源性应用SA或INA时被高水平诱导，而INA似乎是一种模拟SA作用的合成化合物(Ukens等，1992；Cao等，1994)。
本发明还发现编码防护性蛋白质的基因的诱导并不总是依赖于水杨酸途径，但可能与一个完全独立的途径有关。
本发明的第一部分提供了一种保护植物抵抗病原的方法，该方法包括通过刺激茉莉酸酯途径和/或乙烯途径诱导防御素(defensin)基因的表达。
本发明的第二部分提供通过给植物施用一种或一种以上的乙烯，茉莉酸酯，类似于乙烯或茉莉酸酯作用的试剂和产生氧化应激(oxidative stress)的试剂来诱导植物防御素基因表达的方法。
本发明的第三部分提供一种能诱导植物防御素基因表达的组合物，包括一种或一种以上的茉莉酸，茉莉酸酯，乙烯，模拟乙烯或茉莉酸酯作用的试剂和能产生氧化应激的试剂。
本发明的第四部分提供能诱导植物防御素基因表达的化合物，包括一种或一种以上的生成乙烯的化合物，脂质衍生的信号分子，水杨酸，水杨酸的功能性类似物和活性生氧(reactiveoxygen·generating)化合物。
本发明的第五部分提供筛选有抗性诱导(诱导防御素)活性的化合物的方法，该方法包括给一种植物或植物的某些部位施用被认为能产生这类抵抗力并诱导植物防御素基因表达或协同表达的基因之化合物。
本发明的第六部分提供能诱导植物防御素基因表达的启动子，包括被茉莉酸或模拟其作用的试剂和/或乙烯或模拟其作用之试剂所诱导的区域。
本发明的第七部分提供一种启动子区，该启动子区包含在
图14中给出的核酸序列，或与图14中给出之序列基本同源的序列，或其变异序列之中。
优选通过刺激茉莉酸酯途径和乙烯途径来诱导植物防御素基因。
优选病原是死体营养(necrotrophic)的病原。
优选病原是微生物病原。
优选病原是真菌。
优选通过施用乙烯，茉莉酸或茉莉酸酯刺激茉莉酸酯途径和/或乙烯途径。然而，施用模拟乙烯或茉莉酸作用的试剂也有效。而且，似乎是通过施用非除草剂量的可产生氧化力之试剂可诱导植物防御基因的表达。这类基因的实例包括联苯除草剂，如能产生过氧化物阴离子的百草枯或杀草快或能导致产生单氧物质的玫瑰红(rosebengal)。
茉莉酸酯和/或乙烯途径的刺激优先涉及Arabidopsis的信号转导成分EIN2和COI1。然而，这些途径的刺激可涉及其他植物中相应的基因产物，这些基因产物基本上同源于EIN2和COI1。
产生乙烯化合物优选自乙烯，乙烯磷(ethephon)和氨基环丙烷羧酸。
脂质衍生的信号分子优先选自花生四烯酸及其衍生物，亚麻酸及其衍生物以及茉莉酸酯及其衍生物。
活性生氧化合物优选自百草枯，杀草快，玫瑰红和酸性曙红。
可使用任何植物种，但特别适合的植物包括小罗卜，烟草或Arabidopsis属的各种。在使用Arabidopsis属的各种时，防御素可以是植物防御素基因PDF1.2(图14)的产物，与PDF1.2序列或其变异序列基本同源之序列的产物。
如上所述，模拟茉莉酸酯或乙烯活性的化合物也诱导植物防御素基因的表达，这意味着该途径可被用于筛选激活内源性防御机制的化合物。
虽然在筛选中可使用全植物，使用植物的一部分，特别是组织如叶片可能更方便。
该检测可通过任何适当的方法进行，例如对于相关的植物防御素，通过使用抗PDF1.1或PDF1.2基因产物的抗体，或利用报导基因如连接到PDF1.2启动子区的GUS基因或荧光素酶基因进行检测。
本发明方法的一个优点是该方法不涉及使用直接影响活微生物细胞的细胞毒性或潜在有害的化学品，而是利用激活植物中存在的防御机制的化学品。
本发明组合物的一个优点是可利用该组合物使植物对某些类型的病原，例如对死体营养的病原产生抵抗力。或者，通过使用诱导水杨酸，茉莉酸酯和/或乙烯途径的化合物，本发明的组合物可被用于保护植物抵抗广谱病原。
本发明的一个优选实施方案是保护Arabidopsis种的植物抵抗真菌的方法，该方法包括通过刺激茉莉酸酯和/或乙烯途径来诱导植物防御素基因的表达，其中通过用0.5微摩尔甲基茉莉酸酯在含25ppm乙烯的大气中处理叶片来诱导防御素基因的表达。
本发明更为优选的实施方案是为保护植物抵抗多种病原的侵害而诱导植物防御素基因表达的组合物，其中该组合物包括乙烯，甲基茉莉酸酯和水杨酸。在此方法中，水杨酸依赖型防御途径和茉莉酸酯和/或乙烯途径均可被激活。
本发明所使用的术语“其变异体”指对基因序列进行任何取代，变异，修饰，位移，缺失或添加一个或多个核苷酸而产生的序列的产物具有抗病原的活性。该术语还包括基本上与该基因序列杂交的序列。它还包括与本发明的DNA杂交的DNA和编码至少部分该基因序列的DNA。这种杂交优选发生在低或高严紧条件或在两者之间。一般说，低严紧条件可被定义为环境温度为约65℃的3×SSC中，而高严紧条件是约65℃的0.1×SSC。SSC是缓冲液0.15MNaCI,0.015M柠檬酸三钠的名称。3×SSC是SSC浓度的三倍等。
术语“基本同源性”包括基因序列中至少必要之核苷酸的同源性，只要是同源序列起防御素基因作用，即该基因产物能产生对植物病原的抵抗力。一般说，同源性表现为与本发明基因序列有60％或更多的核苷酸相同，更典型的是65％，优选70％，更优选75％，甚至更优选80％或85％，而特别优选的是90％,95％,98％或99％或更高的同源性。
术语“微生物”包括细菌，真菌和病毒。
当微生物侵入时，Arabidopsis中被激活的基因之一是植物防御素基因，其表达不依赖于水杨酸但需要乙烯和茉莉酸反应途径中的功能成分。植物防御素是约5kDa长的富含半胱氨酸的碱性蛋白质之一个家族，其结构上与在各种昆虫的种中发现的抗微生物昆虫防御素相关(Broekaert等Plant,1995)。已知许多这些植物防御素是真菌生长的强抑制剂，这表明它们在宿主防御中起作用。业已显示小罗卜植物防御素基因在转基因烟草植物中的表达提供了对真菌病原Alternania Longipes的抵抗力(Terras等，1995)。病原诱导的植物防御素基因很可能不是通过茉莉酸酯和/或乙烯依赖途径(即非依赖水杨酸途径)激活的唯一基因，但它可被用做检测激活该途径的一种指示剂。然而，在同样途径中起作用的任何其他基因可被用于同样目的。
正如下面实施例中更详尽的描述，编码植物防御素的两个Arabidopsis基因已被发现是表达的。这些基因在寻找与Rs-APE1(一种已知的小萝卜植物防御素)的cDNA核苷酸序列同源的序列之基因库数据时被发现，并且有基因库注册号Z27258和T04323，并被分别指定为PDF1.1和PDF1.2。它们的序列在图1A和1B中被给出，并被标记为序列号1和2。在干种子mRNA(PDF1.1)或秧苗mRNA(PDF1.2)制备的cDNA库中，这些序列被认定为表达序列标签。所述基因编码含一个推定肽信号和一个成熟植物防御素功能区的前蛋白质，它们与小罗卜蛋白质有98％和92％相同。
通过对分离自不同Arabidopsis器官的DNA酶处理的RNA进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析PDF1.1和PDF1.2的表达模式(图2)。作为RT-PCR反应的对照，设计一对引物以扩增相应于Arabidopsis ACTIN-1基因(Nairn等，基因杂志1988)的序列区域，其中包括一个99碱基对的内含子。在此方法中，基因组DNA的PCR扩增产物可依其大小与从RNA得到的真RT-PCR产物区别开。如图2所见，从全部被分析的组织取得的RNA样品，除干种子外，均产生所期望大小的ACTIN-1 RT-PCR扩增产物，而基因组DNA产生一个约100bp以上的PCR产物。用对PDF1.1特异的引物对进行的RT-PCR显示了以长角果和干种子的RNA为模板扩增的产物。在健康植株的任何被分析的组织中，PDF1.2特异的引物对都不产生RT-PCR扩增产物。然而，在对被Alternaria brassicicola MUCL2097株(一种引起褐色坏死损害的真菌该损害不随时间扩散)感染的叶片RNA进行RT-PCR时，检测到了期望大小的扩增产物。用基因组DNA获得的PCR扩增产物比通过从感染的叶片RNA的RT-PCR得到的扩增产物长100bp以上，从而表明PDF-1.2特异的引物跨越PDF-1.2基因中的内含子。这在用PDF1.1特异的引物是观察不到的。
结果是Arabidopsis含两个基因，它们编码高度同源的植物防御素但有完全不同的表达模式。PDF1.1在种子中表达为显性，并被认为与小罗卜Rs-AFP1和Rs-AFP2基因同源，而PDF1.2在受病原侵害的叶片中表达，并被认为与小罗卜的Rs-AFP3和RsAFP4基因同源(Terras等，1995)。
PDF1.1和PDF1.2基因以及它们的表达产物被用于进一步的研究中，这些研究在下面实施例中被更详细的描述。
通过其表达序列的标签(EST)序列鉴定的两个植物防御素基因的表达分析表明它们是差向表达的，而且只有这两个基因中的一个(PDF1.2)表现出病原可诱导性。虽然迄今只鉴定出两个同源的植物防御素(EST)序列，很可能其他植物防御素基因可存在并可能在Arabidopsis中表达，因为用四个独立的限制性内切酶消化Arabidopsis基因组DNA并使用Rs-AFP2 cDNA克隆作为杂交探针的Southern印记分析显示出符合所使用的酶的3到5条带(数据未列出)。目前，在致病期间其他推定的防御素基因的表达模式尚属未知，并且将需要对基因家族做仔细检测。
在目前的工作中，我们已经发现植物防御素基因的表达(至少包括PDF1.2)也受病原感染的整体诱导，并且这种诱导遵循一种明显不同于PR-蛋白质所遵循的反应途径。这个发现基于几个证据。
首先，Arabidopsis植物防御素不受外部使用SA或INA的诱导。相反，用甲基茉莉酸酯或乙烯或产生活性氧物质的化合物百草枯和玫瑰红处理却引起植物防御素转录本的积累。其次，植物防御素基因的病原诱导整体表达在npr-1 Arabidopsis突变株中不被诱导，已知该突变株的SA到PR-蛋白质基因活化反应途径被阻断(Cao等，1994)。其三，在表现组成型上升水平的内源性SA以及PR-1,PR-2和PR-5转录本的cprl Arabidopsis突变株中，植物防御素基因不是组成型地表达(Bowling等，1994)。其四，Arabidopsis的突变株etr1-3,ein2和coi1的分析证明在对真菌感染的反应中植物防御素的诱导似乎涉及来自乙烯和茉莉酸酯反应途径或其共有的成分。因此，这些结果表明两个独立类别的抗真菌蛋白质(分别由PR-1和植物防御素所例举的)在局部和整体均可通过独特的标记过程被诱导出。
Arabidopsis的ein2突变株以在乙烯存在下生长时缺乏形态反应为特征(Guzman和Ecker等，1990)，这种突变株实际上在病原处理的叶片和未受病原处理的整体叶片中，植物防御素基因的病原诱导性表达均被阻断。相反，部分乙烯不敏感型突变株(Chang等，1993)，etr-3突变株在受感染的叶片中具有正常的植物防御素反应，但在受感染的整体叶片中表现为降低的而非消失的植物防御素基因表达。这种由病原感染的etr1-3植株之植物防御素基因表达的不完全抑制最可能是由于这种特殊的突变型等位基因的渗漏引起的。已知对于用甲基茉莉酸酯或花冠素(coronatine)(一种起茉莉酸酯类似物作用的细菌植物毒素)处理抑制根的生长来说，coil突变株比野生型植物敏感性低(Feys等，1994)。这种突变株在病原处理的和未处理的整体叶片中均表现出几乎完全阻断的病原诱导植物防御素反应。
因此，根据这些分析，似乎EIN2和COI1是局部以及整体植物防御素诱导所需要的，而ETR1表现为仅与整体反应有关。在这三个基因中，只有ETR1得到鉴定。ETR1编码一种类似于细菌双组分组氨酸激酶感受器的蛋白质，而遗传学和生物化学证据表明ETR1是乙烯受体(Schaller和Bleecker,1995)。在乙烯反应途径中，基因产物EIN2作用在ETR1的下游(Ecker,1995)。迄今尚未明确COI1的特征，但认为它与茉莉酸酯激发的信号转导有关(Feys等，1994)。
有趣的是，先前业已发现用烈性菌株Pseudomonas Syringae pv.Tomato侵染时，ein2植株表现出比野生型植株低的萎黄病损害(Ben等，1992)。携带etr1-3突变的突变株(先前称为ein1-1)与野生型植株反应类似。虽然ein2植株与野生型和etr1-3植株相比显示降低的疾病症状，P.Syringae pv.tomato细菌在这三种基因型中增殖得同样好。
图9描述在病原侵入时，导致诱导防御相关基因的两个独立途径的一个模型。在此模型中，过敏反应被定位在分叉点之上，因为发现发生自动过敏反应样损害的Arabidopsis的acd2突变株(Greenberg等，1994)含增高的植物防御素转录本水平和PR-蛋白质转录本水平(Greenberg等，1994)。通过水杨酸导致PR-蛋白质基因表达的途径涉及信号转导组分NPR1和CPR1，而导致植物防御素基因表达的途径需要EIN2和COI1。在两种防御反应途径之间也可存在某种程度的交流，并且似乎SA抑制作用的积累使得茉莉酸酯途径和/或乙烯途径，即SA非依赖途径的活动增强。在此方面，乙酰水杨酸表现出抑制茉莉酸酯的合成途径(Pena-Cprtes等，1993)，而SA被发现抑制由茉莉酸产生的蛋白酶抑制因子的诱导作用(Doares等，1995)。
通过上面描述的SA非依赖途径，用植物防御素可激活其他防御相关基因。第一个可能的待选基因是Hel，一种橡胶蛋白样(hevein-like)基因(PR-4)，该基因在病毒感染时在局部和整体均被诱导(Potter等，1993)。Hel受乙烯的强诱导，但仅受SA的弱诱导，而PR-1,PR-2和PR-5为非乙烯可诱导的，却是强的SA可诱导的(Potter等，1993)。第二种待选基因是硫堇基因Thi2.1,该基因在真菌感染时和在甲基茉莉酸酯处理时被诱导，但不在SA处理时被诱导(Epple等，1995)。第三种可能的待选基因是碱性壳多糖酶基因CHIT-B，该基因在乙烯处理野生型植株时被诱导，但在ein2或etr1-3突变株中不被诱导(Chen和Bleecker,1995)。具观察，Arabidopsis的病毒感染的叶片中CHIT-B的诱导与PR-1,PR2和PR-5的诱导相关(Dempsey等，1993)。
在烟草中也有有关两个独立的病原可诱导反应途径存在之证据。第一个途径导致酸性PR-蛋白质基因如PR-1,PR-2,PR-3(酸性壳多糖酶)，PR-4和PR-5的诱导，而第二个途径导致碱性β-1，3-葡聚糖酶和碱性壳多糖酶基因的诱导表达。第一组基因被SA强激活，而第二组基因受乙烯激活(Meins等，1991)。有趣的是，表达编码霍乱毒素A1亚单位的一个基因(G蛋白抑制基因)的转基因烟草植物表现出酸性PR-蛋白质基因的组成型表达，但没有碱性β-1,3-葡聚糖酶和碱性壳多糖酶的组成型表达(Beffa等，1995)。用烟草花叶病毒(TMV)侵入时，酸性PR-蛋白质在局部和整体均被诱导(Ward等，1991；Brederode等1991)。在另一方面，碱性β-1，3-葡聚糖酶和碱性壳多糖酶基因在被接种的叶片中也被强诱导，但在其整体可诱导性方面存在矛盾的证据。基于RNA杂交分析，在TMV感染的植物的未接种叶片中不能检测到这些基因的明显增高的转录本水平(Ward等，1991；Brederode等，1991)，而基于Western杂交分析，在这些叶片中发现了相应的蛋白质的积累(Heitz等，1994)。
可推测在烟草中，病原诱导的碱性β-1,3-葡聚糖酶和碱性壳多糖酶基因的表达遵循一种相当于在Arabidopsis中导致诱导植物防御素基因表达的途径。一个明显的区别是植物防御素的在整体叶片的诱导表达发生在转录水平和蛋白质水平上。应该考虑到Arabidopsis比烟草要小的多，因此在前者检测整体反应所覆盖的距离比后者短的多。在一方面烟草中的碱性β-1,3-葡聚糖酶与碱性壳多糖酶表达和另一方面Arabidopsis中的植物防御素基因的表达之间另一明显的差别是烟草基因是损伤可诱导的(Brederode等，1991)，而Arabidopsis中的植物防御素基因则不然。
我们已经证明与从小罗卜(Rs-AFP1)产生的抗PDF1.2类似物抗体交叉反应的一种病原诱导蛋白质在体外具有强的抗真菌活性。该蛋白质在真菌感染时累积到很高的水平，即分别在接种和未受处理的整体叶片中上升到总蛋白质的2％和1％。我们先前已表明以约为总可溶性蛋白质的25％的水平从小罗卜诱导PDF1.2类似物的转基因烟草对A.longipes比非转化的植物有更高的抗性(Terras等，1995)。基于这些观察，很可能植物防御素在宿主抵抗力中发挥作用。目前的非常有力的证据是SA依赖型途径在产生对某些病原(包括P.syringaepv.tomato和Peronospora parasitica)的抵抗力方面是重要的。实际上，曾发现表达nagG的植物对这些病原相对于野生型植物来说更敏感(Delaney等，1994)并且，与野生型植物不同，它们不能产生整体获得性抵抗力(Lawton等，1995)。本文描述的证据表明SA非依赖型途径(导致植物防御素基因和可能的其他防御相关基因的激活)也对抵抗力有用，尽管是对不同类型的病原。实际上，我们已表明在SA非依赖型途径中明显被阻断的ein2和coil突变株比野生型植物更易于受Botrytis cinerea的感染。
现在本发明将仅通过下述实施例和图解以实施例的方式被进一步描述，其中图1表示分别相应于PDF1.2和PDF1.2的表达序列标签Z27258和T04323的核苷酸序列及推导出的氨基酸序列。
(A)相应于PDF1.1的Z27258的核苷酸序列及推导出的氨基酸序列。先前被称作为At-AFP1的从实验上确定的PDF1.1N端区(Terras等，1993)被下划线。在位置123(Z27258中的T)的核苷酸已被附加序列数据的G取代。
(B)相应于PDF1.2的T04323的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。
(C)将来自小罗卜种子和叶片的成熟Rs-AFP1和Rs-AFP3的氨基酸序列分别与PDF1.1的成熟功能区和PDF1.2推导的成熟功能区对比排列。
在(A)和(B)相应于用在RT-PCR的引物的位置中的被下划线的核苷酸序列。
图2表示在Arabidopsis中PDF1.1和PDF1.2的表达模式；(A)使用PDF1.1特异性引物对的RT-PCR分析。
(B)使用PDF1.2特异性引物对的RT-PCR分析。
(C)使用ACTIN-1特异性引物对的RT-PCR分析。
RT-PCR在从不同Arabidopsis来源分离到的无DNA酶总RNA上进行。根，茎，花苞，开放的花和长角果从7周龄开花植物收集到。叶片和被感染的叶片从4周龄的植物收集到。感染的叶片与A.Brassicicola一起培养，3天后收集。
图3表示来自感染的Arabidopsis叶片的植物防御素的纯化和表征；(A)在C2/C18硅胶反相层析柱上分离健康的Arabidopsis叶片(上部)和A.brassicicola感染的Arabidopsis叶片(下部)的碱性蛋白质组分。用线性梯度为0％到50％(v/v)的硝基丙酮在0.1％(v/v)的三氟醋酸中洗脱该层析柱。
(B)电泳分析在峰1中所含蛋白质。在SDS-PAGE凝胶(Phastgel High Density,Pharmacia)上电泳峰1中所含200ng的蛋白质和200ng纯化的Rs-AFP2并染色。分子量标记的大小以千道尔顿为单位在左面标出。
(C)SDS-PAGE电泳后，用抗Rs-AFP1抗体对峰1所含蛋白质的免疫印记。在载样孔中加入200ng的纯化Rs-AFP或200ng的纯化峰1所含蛋白质。
(D)水中A.brasssicicola的体外抗真菌活性(阴性对照，左面)，纯化的5微克/毫升浓度的Rs-AFP2(中间)或5微克/毫升纯化的峰1所含蛋白质(右面)。22℃温浴24小时后进行微离心。
图4表示植物防御素在真菌感染的Arabidopsis中表达；(A)在病原处理的叶片(1°)和被感染植物的未处理的整体叶片(2°)中PDF1.2和β-微管蛋白(β-TUB)表达的RNA凝胶印记分析。全部被分析的样品为4微克的RNA。
(B)在病原处理的叶片(圆圈)和被感染植物的未处理的整体叶片(方框)中植物防御素(PDF)含量如使用抗原亲和纯化的抗-Rs-AFP1抗血清在ELISA所确定的。测定值是三个独立测定的平均数(±标准误)。
总RNA和蛋白质从病原处理的和未处理的整体Arsbidopsis叶片分离到，其中收集以5×105个孢子/毫升接种5微升液滴(每叶片5滴)后0小时，3小时，6小时，12小时，24小时，48小时，72小时和96小时的叶片。
图5表示化学处理和损伤的Arabidopsis中，植物防御素的诱导；(A)RNA凝胶印记分析在受损伤或用所指明的化学品处理的叶片中PDF1.2和β-微管蛋白(β-TBU)的表达。所有被分析的样品为4微克的总RNA。
(B)植物防御素(PDF)的含量如通过ELISA方法用抗原亲和纯化的抗Rs-AFP1抗血清所测定的。测定值是三个独立测定的平均值(±标准误)。
用5微升液滴(每只叶片5滴)的水，SA(5毫摩尔)，INA(1毫克/毫升)，百草枯(25微摩尔)，玫瑰红(20毫摩尔)，甲基茉莉酸酯(45微摩尔于0.1(v/v)乙醇中)或0.1％(v/v)乙醇(0.1％EtOH)接种Arabidopsis叶片。乙烯处理是通过将植物放置于隔绝空气的装有20ppm浓度乙烯的小室中进行的。对照植物(在空气中)培养在无乙烯的同样小室中。通过用解剖刀在叶片上切口的方法造成损伤。全部叶片样品在处理开始后的48小时收集。本实验以类似的结果重复一次。
图6表示在野生型Arabidopsis(Col-0)中，和在SA-信号途径中受影响的Arabidopsis突变株(npr1和cpr1)中植物防御素的诱导。
该图左侧部分表示PDF1.2表达的RNA凝胶印记分析。该样品为4微克的总RNA。
右侧部分表示通过ELISA方法使用抗原亲和纯化的抗Rs-AFP1抗血清所测定的植物防御素(PDF)含量。测定值是三个独立测定的平均值(±标准误)。
通过在四个下层莲座叶(rosette)叶片上(每只叶片5滴)施用5滴孢子悬液(5×105孢子/毫升)的方法将A.brsssicicola(A.bras.)接种给Arabidopsis植物。对照植物用5微升液滴的水(H2O)同样方法处理。接种3天后，收集病原处理过的叶片(1°)和同样植物而未处理的叶片。用所描述的方法(参见方法)提取总RNA和蛋白质。重复同样结果的实验两次。
图7表示在Arabidopsis野生型(col-0)中，受乙烯反应途径影响的Arabidopsis突变株(ein2和etr1-3)中和在受茉莉酸酯反应途径影响的一个突变株(coil)中的植物防御素的诱导。
该图左侧部分表示PDF1.2表达的RNA凝胶印记分析。该样品为4微升的总DNA。
右侧部分表示通过ELISA方法使用抗原亲和纯化的抗Rs-AFP1抗血清测定的植物防御素(PDF)含量。测定值是三次独立测定的平均值(±标准误)。
通过在四个下层的莲座叶丛叶片上(每只叶片5滴)施用5微升液滴孢子悬液(5×105孢子/毫升)的方法将A.brassicicola(A.bras.)接种给Arabidopsis植物。对照植物用5微升液滴的水(H2O)同样方法处理。接种3天后，收集病原处理过的叶片(1°)和同样植物而未处理的叶片。用所描述的方法(参见方法)提取总RNA和蛋白质。重复同样结果的实验两次图8表示在Arabidopsis野生型(col-0)和Arabidopsis损伤模拟突变株中植物防御素的诱导。
(A)PDF1.2表达的RNA凝胶印记分析。全部被分析的样品为4微克的总RNA。
(B)如通过ELISA，使用抗原亲和纯化的抗Rs-AFP1抗血清所测定的植物防御素(PDF)含量。测定值是三次独立测定的平均值(±标准误)。
(C)总RNA分离自5周龄acd2植物收集的健康的无症状的上层莲座叶丛叶片(UH)和表现坏死的损伤(LN)的下层莲座叶丛叶片，以及分离自同样条件下的对照植物(Col-0)的健康上层莲座叶丛叶片(UH)和下层莲座叶丛叶片(LH)。该实验以同样结果重复两次。
图9是所提出的通过两个独立的途径，即水杨酸依赖途径和茉莉酸酯和/或乙烯依赖途径诱导防御相关基因的模型。
图10表示在病原侵入的Arabidopsis植物的PDF1.2基因激活期间乙烯和茉莉酸酯信号相互作用的三个可相互替代的模型。
图11表示用A1ternaria brassicicola接种(关闭的标志)或用水模拟接种(打开的标志)时，Arabidopsis野生型植物(Col-0，上面)和乙烯不敏感突变株(ein2，下面)中各时期的茉莉酸水平。
每个数据点是对每组三个植株的两组所做的两个独立测试之平均值。
图12表示用Alternaria brassicicola接种(关闭的标志)或用水模拟接种(打开的标志)时，Arabidopsis野生型植物(Col-0,上面)和茉莉酸酯不敏感突变株(coil，下面)中各时期的乙烯生产水平。Col-0的数据是每个时间点用两种植物进行的三个独立实验的平均值。Coil的数据来自每个时间点用两种植物进行的单次实验。
图13表示在用0.1％乙醇(con)或50微摩尔0.1％乙醇中的甲基茉莉酸酯(MeJA)处理时Arabicopsis野生型植物(Col-0)和乙烯不敏感突变株(ein2)中植物防御素的诱导。
图14表示ArabidopsisPDF 1.2基因的核苷酸序列。圈起的核苷酸代表表达序列标签T04323的第一个核苷酸。基因产物的氨基酸给出在编码区相应的密码子下。内含子以下标字符表示。
图15表示用A.brassicicola(模拟或孢子接种)或B.cinerea(模拟或豹子接种)接种时，转基因pPDF1.2-GUS-tNOS Arabidopsis植物的β葡糖苷酸酶活性。处理后3天内收集处理的叶片(1°)和同株未处理的叶片(2°)。结果被表示为四组两个植株的平均值±标准误。
图16表示用各种化学品处理时转基因pPDF 1.2-GUS-tNOSArabidopsis植物(A部分)和转基因pBg12-GUS-tNOS Arabidopsis植物(B部分)中的β葡糖苷酸酶活性。
图17表示用烟草花叶病毒或模拟接种的转基因pPDF1.2-GUS-tNOS烟草(也可用Xanthi-nc)植株中β葡糖苷酸酶活性。病毒或模拟接种恰好在最嫩的完全伸展开的叶片之下的叶片。这些叶片(1°)，最嫩的完全伸展开的叶片(2°)和恰好在最嫩的完全伸展开的叶片之上的叶片(3°)于处理后的两天内(黑色条块)，4天内(亮灰色条块)或6天内(暗灰色条块)被分别收集。
图18表示用各种化学品处理或损伤的转基因pPDF1.2-GUS-tNOS烟草(也可用Xanthi-nc)植株中的β葡糖苷酸酶活性。处理后48小时收集处理的叶片样品。
图19表示接触25ppm乙烯时，用0.5微摩尔甲基茉莉酸酯(MeJA,0.1％乙醇中)，333微摩尔乙烯磷，25ppm乙烯加0.5微摩尔甲基茉莉酸酯处理的转基因pPDF1.2-GUS-tNOS Arabidopsis植株中β葡糖苷酸酶活性，而适当的对照植株的处理是接触空气并用水和0.1％乙醇处理。
图20表示用真菌病原Botrytis cinerea接种后，Arabidopsis野生型植株(Col-0，圆圈)，乙烯不敏感突变株(ein2，三角)和茉莉酸酯不敏感突变株(coil，方块)的腐烂。数据代表含用每个植物品系20个植株系列进行的四个独立的实验(Col-0和ein2)和三个独立的实验(coil)的标准差的平均值。
图21表示在接种的Arabidopsis野生型植株(Col-0)以及ein2,coil和npr1突变株的叶片中，真菌Peronospora parasitica致病变型Wela的菌丝结构的乳酚/锥虫蓝染色。方法生物材料突变株npr1(Cao等，1994)和cpr1(Bowling等，1994)由X.Dong博士提供(Duke University,Durham,NC,USA)。乙烯反应突变株ein2(Guzman和Ecker,1990)和etrl-3(Bleecker等，1988；Chang等，1993)从Arabidopsis生物资源中心，OH,USA获得(注册号分别是CS3071和CS3070)损伤模拟突变株acd2(Greenberg等，1994)由F.Ausubel博士提供(Massachusetts General Hospital,Boston,USA)。茉莉酸酯反应突变株coil(Feys等，1994)从J.Turner处获得(University of East Anglia,Norwich,UK)。由于这只突变株是隐性并引起雄性不育，coil突变株被鉴定为是由自花受精的COIl/coil半合子植株的种子生长成的F2代植株中的一个后代(posteriori)。因此，对F2代群体进行下述不同的处理，来自每个个体的叶片被分别收集并是植株继续成长直到播种。那些不形成长角果的个体被鉴定为有coil/coil基因型。根据在50微摩尔甲基茉莉酸酯中体外发芽的幼苗根的长度预选用于该病检测的coil突变株。上面所列全部突变株品系由Columbia(Col-0)生态型衍生而来。真菌A.brassicicola(MUCL 20297；Mycotheque UniversiteCatholique de Louvain,Louvain-1a-Neuve,Belgium)的成体和孢子的收获按先前的描述进行(Broekaert等，1990)。植株生长条件，化学品的应用和接种Arabidopsis种子被播种在培养皿中栽种花的含常量营养素补充成分(Asef.Didam,The Nehterlands)之混合肥上。播种后，所述种子在4℃被春化处理2天。在一个生长温室(昼温20℃，夜温18℃，在100μEm-2s-1的光子流量密度下12小时光照周期)中培育5天后，移栽到含常量营养素补充的栽种混合肥的花盆中并在与上述同样条件下生长。用自来水通过装载花盆的托盘进行浇灌。用带有加固末端的镊子碾碎的办法损伤叶片，或用手术刀在枝条上形成切口，注意保持中脉完整。百草枯(25微摩尔)，玫瑰红(20毫摩尔)，甲基茉莉酸酯(40微摩尔在0.1％(v/v)乙醇中)，0.1％(v/v)乙醇，水杨酸钠(5毫摩尔)和INA(1毫克/毫升25％活性成分，在可湿粉末中，由瑞士Basel,Novartis的H.Kessmann博士提供)以托架之间表明的浓度在叶片上施用5微升液滴(每叶片5滴)。甲基茉莉酸酯储存液是45毫摩尔的乙醇溶液。乙烯处理通过将花盆放在不透气的半透明温室中进行，通过一个硅胶薄膜向其内注入乙烯气体。用气相层析查实温室中的乙烯浓度。乙烯实验的对照植株被放置在没有乙烯的同样温室中。通过施用5微升液滴的孢子悬液(在蒸馏水中5×105孢子/毫升)在四个下层莲座叶丛的叶片上(每叶片5滴)接种A.brassicicola。对照植株用蒸馏水滴同样处理。带有孢子悬液和水的液滴的植株被随机(若同时处理不同的基因型的话)放在有聚苯乙烯覆盖的播种池中并保持高湿度2天以刺激菌丝germlings的感染。在孢子悬液液滴接种的48小时内，隔离的A.brassicicola和本文使用的接种条件产生有限的黄色枯损伤，而且这些损伤不能进一步扩散。RNA印记分析通过Eggermont等(1996)的苯酚/LiCI方法从在液氮中冷冻并在-80℃储存的组织中提取RNA。以每孔4微升将RNA样品上载到甲醛-琼脂凝胶上，并通过20×SSC(Sambrook等1989)毛细管转移法印记到带正电荷的尼龙膜上(Boehringer Mannheim,Mannheim,Germany)。为证实RNA的可比性及RNA的转移，给上载缓冲液补充50微克/毫升溴酚蓝，以使紫外照射时凝胶中的RNA和印记肉眼可见。用毛地黄毒苷标记的反义RNA探针与印记预杂交和杂交并用如前所述的免疫化学荧光法显色(Terras等，1995)。用BoehringerMannheim的Dig RNA标记试剂盒通过逃逸转录法制作毛地黄毒苷标记的探针。用SP6 RNA聚合酶和被EcoRⅠ线性化的含Genbank注册号T04323表达序列标签的质粒pZLI(BRL life Technologies,Gaithersburg,MD,USA)合成PDF1.2探针。用T7 RNA聚合酶和EcoRⅠ线性化的含Genbank注册号Z26191表达序列标签的质粒pBluescript Ⅱ SK(Stratagene,Lajolla,CA,USA)合成微管蛋白β-1链基因两个质粒从Arabidopsis生物资源中心(Columbus,0H,USA)得到。用不同探针分析的样品在一式双份凝胶上电泳并分别显色。逆转录PCR总RNA(1微克于100毫摩尔醋酸钠/5毫摩尔硫酸镁，pH5.0)用6单位无RNase的DNaseⅠ(Boehringer Manheim)在37持续5分钟，然后通过95℃加热5分钟，使DNA酶失活。该RNA在O.2摩尔醋酸钠和66％(v/v)乙醇中沉淀过夜，通过10000xg离心10分钟收集，用70％(v/v)乙醇洗两次并最后溶解于无RNA酶的水中。用10单位的鸟类成髓细胞增多症病毒逆转录酶(Pharmacia,Uppsala,Sweden)和1μg DNA酶处理的总RNA在52℃下进行逆转录反应60分钟。用同聚物脱氧胸苷寡核苷酸(20-mer)进行逆转录反应并通过加入Na-EDTA到终浓度为15毫摩尔终止反应。一份(三十分之一)逆转录反应溶液在用2.5单位的Taq聚合酶(Appligene,Pleasanton,CA,USA)按照Sambrook等人(1989)的方法进行的50微升PCR反应中作为模板。所述PCR反应进行30个循环，在55℃,65℃和65℃分别用对PDF1.1,PDF1.2和ACTIN-1专一的引物对扩增。用于PDF1.1扩增的引物是OWB260(有义链5’-GAGAGAAAGCTTGTTGTGCGAGAGGCCAAGTGGG-3’)；和OWB259(反义链5’-GAGAGAGGATCCTGCAAGATCCATGTCGTGCTTTC-3’)，用于PDF1.2扩增的引物是OWB240(有义链5’-AATGAGCTCTCATGGCTAAGTTTGCTTCC-3’)；和OWB241(反义链5’-AATCCATGGAATACACACGATTTAGCACC-3’)；和用于ACTIN-1扩增的引物是OWB270(有义链5’-GGCGATGAAGCTCAATCCAAACG-3’)；和OWB271(反义链5’-GGTCACGACCAGCAAGATCAAGACG-3’)。从A.brassicicola感染的Arabidopsis叶片纯化植物防御素用5微升液滴的蒸馏水(对照)或A.brassicicola孢子悬液(5×105孢子/毫升水)接种5周龄Arabidopsis植株的叶片，并于接种3天后收集在一个有透明的聚苯乙烯盖的潮湿播种池中。从20克水处理的或接种的叶片制备提取物，并完全按照前面描述的Terras等(1995)的方法进行纯化。按照先前的描述(Terras等，1995)在预先制备好的PhastGel High Density凝胶(Pharmacia)上进行蛋白质测定，体外抗真菌活性测定和SDS-PAGE分析。在SDS-PAGE分析之前，按照Terras等(1992)所描述的，用二硫赤藓糖醇和S-乙基化吡啶还原蛋白质样品。按Terras等(1995)所描述的，在15％丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶上分离的蛋白质进行免疫印记。ELISA分析从提取缓冲液(10毫摩尔磷酸二氢钠，10毫摩尔磷酸氢二钠，100毫摩尔氯化钾，1.5％(w/v)聚乙烯聚吡咯烷酮，pH7)中的冷冻叶片物质分离蛋白质。在根据Bradford(1976)所得到的粗提物中用牛血清白蛋白做标准测定蛋白质浓度。在对粗提物的热处理(80℃,10分钟)后，在竞争性ELISA中进行热稳定可溶性蛋白质片段的分析。
用100ng/mlRsAFP2在包被缓冲液(10毫摩尔碳酸钠，35毫摩尔碳酸氢钠，pH9.6)中包被ELISA微量滴定板(GreinerLabortechnik)37℃持续2小时。在未包被部位用3％(w/v)冷鱼皮胶(Sigma)在磷酸盐缓冲生理盐水中(PBS)(37℃2小时)封闭。在含0.05％(v/v)吐温-20的0.3％(w/v)明胶PBS溶液中稀释亲和纯化的初级抗体50倍并同时与等体积(50微升)的样品缓冲液中的被稀释样品一起施加到孔中。该平板在37℃温孵1小时。用含0.1％(v/v)Tween20的PBS数次洗涤后，将含0.05％(v/v)Tween20的O.3％凝胶PBS液稀释1000倍的第二抗体(与碱性磷酸酶偶联的羊抗兔抗体)充填到平板的孔中(每孔100微升)。所述平板在37℃温孵1小时。用1毫克/毫升底物缓冲液(20毫摩尔碳酸钠，35毫摩尔碳酸氢钠，5毫摩尔氯化镁，pH9.6)浓度的底物4-磷酸硝基苯(Janssen Chimica,Beerse,Belgium)在37℃温孵30-60小时后，通过测量450nm的光吸收检测碱性磷酸酶的活性。以一式三份制备4倍稀释系列的蛋白质样品，并参照纯化的Rs-AFP1(Terras等，1992)两倍稀释系列标准，检测植物防御素浓度。
抗Rs-AFP1抗血清的亲和纯化按下面方法进行。通过混合与Affi-Gel10基质(Bio-Red Laboratories,Hercules,CA,USA)等体积的20毫克/毫升纯化Rs-AFP1的100毫摩尔3-N-吗啉代丙磺酸缓冲液(pH7)制备抗原亲和柱。该混合浆料在4℃连续轻微搅拌下过夜。通过加入0.025体积的1摩尔乙醇胺(pH8)封闭基质的非反应部位后，用10毫摩尔Tris(pH7.5),100毫摩尔甘氨酸(pH2.5),10毫摩尔Tris(pH8.8)和100毫摩尔三乙胺(pH11.5)顺序洗该柱，并用10毫摩尔Tris(pH7.5)饱和。兔抗Rs-AFP1抗血清被两倍稀释于ImmunoPure Gentle抗原/抗体结合缓冲液中(Pierce ChemicalCompany,Rockford,IL,USA)并通过该亲和柱数次。用15个体积的ImmunoPure Gentle抗原抗体结合缓冲液洗该柱后，用ImmunoPureGentle抗原抗体洗脱缓冲液(Pierce Chemical Company)洗脱纯化的抗Ps-AFP1抗体。通过测量280nm的光吸收监测结合抗体的洗脱。洗脱组分被PBS透析过夜。Arabidopsis PDF1.2基因启动子区的扩增，克隆和DNA序列分析以反向聚合酶链反应(该方法详细过程参见Gasch等1992)为基础的方法被用于扩增PDF1.2基因的5’调节序列。相应于PDF1.2cDNA的Genbank注册号为T04323的表达序列标签(EST)DNA序列被用于设计扩增Arabidopsis基因组的5’基因组旁侧序列的引物。总基因组DNA是用Dellaporta等人的方法(Dellaporta)，分离自Arabidopsis生态型为Col-0的约8周龄植株之10克湿重的叶片。通过悬浮于CsCI溶液中并在45,000转/分钟离心，进一步纯化所述DNA，该CsCI溶液的最终密度是1.55毫克/毫升并含0.75毫克/毫升的溴乙锭。然后用注射器从离心管中移出分带的DNA，用通过异戊醇分层移去溴乙锭，然后用乙醇沉淀DNA。被沉淀的DNA被溶解在水中，然后用10单位的限制酶Sph1在40微升反应液中37℃消化120ng的DNA1小时。已知EST T04323含内部Sph1识别位点(位于174到179碱基处)，因此该酶被用于切开基因组片段，所述片段含有上述cDNA的前178个碱基，任何间隔序列和EST序列的上游到该基因组DNA中第一个Sph1识别位点的任何5’序列。所述反应在65℃加热灭活10分钟，简单离心并用乙醇沉淀悬浮液中的DNA。然后在使用1单位的T4DNA连接酶和该酶供应商提供的缓冲液(BoehringerMannheim)的标准50微升反应液中14℃过夜，自体连接被消化的约30ngDNA。通过65℃加热10分钟终止连接反应，简单离心并用乙醇沉淀悬浮液中的DNA。然后加入10ng连接好的DNA样品作为50微升聚合酶链反应(PCR)的模板，其中含200微摩尔dNTPs和各1微摩尔的引物0WB257[5’GAGAGAGGATCCAACTTCTGTGCTTCCACCATTGC-3’,BamHⅠ识别位点被下划线]和OWB256[5’-GAGAGAAAGCTTGAAGCCAAGTGGGACATGGTCAGG-3’,HindⅢ识别位点被下划线]。这些引物分别对应于EST T04323序列中的部位104-127和133-156，但顺序相反，并且只有在侧翼序列是通过以末端Sph1识别位点的基因组片段自体连接反应连接的情况下才能扩增。PCR反应液含1单位的TaqDNA聚合酶(在第一次热循环反应达95℃时加入)和供应商(Appligene Inc.)提供的反应缓冲液。PCR反应按照下列热循环程序进行。首先，在95℃加热4分钟，在此期间加入Taq聚合酶，接着进行30个95℃×30秒，56℃×2分钟(退火温度)和72℃×1分钟的循环，最后的循环是95℃×30秒，56℃×2分钟和72℃×10分钟。加入相当于0.05微升的该反应液样品作为第二次PCR反应的模板，该反应除没有加入基因组DNA而加入一套引物OWB255[5’-GAGAGAGGATCCAGCAGCAAAGCGAACAAGAGCAGCG-3’BamHⅠ识别位点被下划线]代替引物OWB257外其他均相同。引物OWB255对应于T04323序列中67-91位。该反应进行同样的热循环程序，不同的是56℃步骤被提高到58℃。得到约1.3kb和0.8kb的两个DNA片段。从琼脂糖凝胶分离大片段，用HindⅢ和BamHⅠ消化并连接到用HindⅢ和BamHⅠ预先消化的pEMBL18+中。该克隆被命名为pJMiPCR-1t。用双脱氧核苷酸终止试剂和M13向前和M13反向引物对插入片段做部分测序。这些部分序列表明插入片段含相同于那些预期从EST T04323呈现的序列，并且鉴定出用于自体连接的Sph1限制位点侧翼的部分序列。然后设计与pJMiPCR-It插入片段中Sph1位点相邻的序列上的寡核苷酸引物，该序列被预期含有PDF1.2基因5’启动子区所在的序列。所述引物被命名为OWB273[5’-AAGAAAGCTTATGCATGCATCGCCGCATCGATATCCC-3’,HindⅢ识别位点被下划线]。所述引物被用于与引物OWB276[5’-GAGAGAAGCTTATTTTTATGTAAAATACACACGATTTAGCACC-3’,HindⅢ识别位点被下划线]结合使用的PCR反应，其中含对应于EST T04323序列中部位292-326的序列。一旦反向PCR反应扩增了PDR1.2基因的5’上游序列，这些引物就会扩增位于T04323序列326位5’端的PDF1.2基因的基因组DNA全序列，并且所述区域应延伸直到5’上游启动子区的Sph1识别位点。使用Arabidopsis生态型的10ng完整基因组DNA作为模板，用上述这些引物，58℃为退火温度进行PCR反应。如凝胶电泳所判断的，该PCR产生大小约为1.6kb的单一片段。从凝胶切下该电泳区带并用HindⅢ消化，连接到HindⅢ切开的去磷酸化的pEMBL18+中。该克隆被命名为pFAJ3085，并用荧光素标记的双脱氧试剂和Applied Biosystems 373A DNA序列分析仪以交叠法对该插入片段的两条链进行完全测序。构建PDF1.2启动子-报导子构建体并转化Arabidopsis和Tobacco用引物OWB272[5’-GAGAGAGGATCCTGATGGAAGCAAACTTAGCCATG-3’,BamHⅠ识别位点被下划线]和0WP273扩增启动子片段和PDF1.2基因的部分编码区序列(位置在pFAJ3085插入片段的1-1254)。该反应使用1ng的pFAJ3085作为模板并在使用56℃退火温度前进行。得到预期的片段并用凝胶纯化。用HindⅢ和BamHⅠ双酶解该片段，然后连接到市售双载体质粒pBI101.3(Clontech Inc.)中。该载体含有可使用Agrobacterium tumefaciens为媒介物转移给植物的T-DNA。当在植物细胞中表达时，T-DNA上有一个提供卡那霉素抗性的可选择性标记基因。此外，一个含HindⅢ和BamHⅠ识别位点的多接头与Escherichia coli的UidA(编码β-葡糖苷酸酶或GUS)顺反子编码区5’紧邻，在该区域的下游邻接的是Agrobacteriumtumefacients(tNOS)胭脂碱合成酶基因。由OWB272和OWB273扩增的PDF1.2基因之被HindⅢ/BamHⅠ消化的启动子插入到所述区域中导致一个基因的融合，其中可以预料在PDF1.2基因的预期正常翻译起始部位开始翻译会导致产生与下述N端序列在一起的GUS融合蛋白MAKFASIRIPGYGQSLM，其中下划线氨基酸残基得自七个N末端PDF1.2密码子，标准(normal)字符表示在pBI101.3载体上编码的氨基酸残基，而最后的斜体M残基是由UidA顺反子编码的GUS酶的N末端残基。所述含镶嵌pPDF1.2-GUS-tNOS基因的载体被命名为pFAJ3086。用OWB273和市售引物[GUS Sequencing Primer,ClontechInc.5’-TCACGGGTTGGGGTTTCTAC-3’]扩增pFAJ 3086中的插入片段，并直接对PCR产物的末端序列测序以证实PDF1.2基因序列已被正确结合。
然后，为促进结合，通过使用含载体pRK2013的E.coli HB101菌株进行的三亲本杂交将pFAJ3086转移给Agrobacteriumtumefaciens株LBA4404(Ditta等)。通过叶片转盘法(leaf disc)(Horsch等)用含有pFAJ3086载体的A.tumefaciens株转化Nicotiana tabacum cv.Xanthi-nc的叶片移植体和转化使用根外植体的Arabidopsis thaliana生态型C24。病害检测Arabidopsis上Botrytis cinerea的病害检测进行如下。在温室中盆栽混合肥上种植Arabidopsis植株(22℃，以光子流通密度为80uEm-2s-1光照周期14小时，相对湿度为70％)。在播种后三周，用针刺方法(每叶片3针)损伤全部展开的叶片。用5微升液滴悬浮在半加强马铃薯葡萄糖肉汤(Difco)中的Botrytis cinerea(105孢子/毫升)悬液覆盖受伤部位。接种后的植株被随机种植在盖有透明聚苯乙烯盖的播种池中并如上面方法培育，不同的是光子流通密度被降低到50μEm-2s-1。两天后，揭开盖，在同样条件下继续培育植株。当包括嫩枝尖端和最嫩的叶在内的茎完全腐烂时认为植株死亡。
Arabidopsis受到Peronospora Parasitica感染的检测如下。通过在水中轻筛Arabidopsis生态型Weiningen的受感染叶片筛选P.parasitica pathowar Wela的分生孢子。将分生孢子悬液调整到10-5孢子/毫升并用植物喷壶喷洒到四周龄的植株上。接种过的植株被随机种植在有透明聚苯乙烯盖的播种池中并在20℃，光子流量密度为80μEm-2s-1的光照周期为8小时中培育7天。通过用乳酚/锥虫蓝染色法(Keogh等)染叶片以显示真菌结构来检测病害的进展情况。实施例1有抗真菌活性的植物防御素在病原应激的Arabidopsis叶片中积累为研究是否Arabidopsis中病原诱导的植物防御素具有生物活性，我们试图通过先前研发的从真菌感染的小罗卜叶片纯化Rs-AFP3和Rs-AFP4(Terras等，1995)的一个方法纯化蛋白质。简言之，该纯化方法包括使粗叶片蛋白质提取物过pH7.5的阴离子交换柱，使未结合的蛋白质过pH5.5的阳离子交换柱，在高离子强度下洗脱结合的蛋白质，和最后过反向层析柱分离洗脱的蛋白质。将来自未接种Arabidopsis植株叶片的蛋白质的反向层析与来自接种了A.brassicicola的叶片之反向层析比较，使得鉴别出只在后者才出现的峰(图3A峰1)。SDS-PAGE分析显示在此峰的组分中的蛋白质与Rs-AFP1一起共迁移(comigrating)(图3B和3C)表现为一个单一的5kDa带。在SDS-PAGE凝胶制备的免疫印记中以及用抗Rs-AFP1抗血清显色中，该蛋白质与Rs-AFP1一样清楚可见(图3C)。而且，该蛋白质组分被证明抑制A.brassicicola(图3D)和Fusuarium culmorum(结果未出示)的体外生长。生长抑制作用的特征体现在菌丝体的高分枝和尖端膨胀，如在Rs-AFP1(图3D)所观察到的和从其他Brassicaseae，包括Arabidopsis种子(Terras等，1993)的PDF1.1(以前称为At-AFP1)的相关植物防御素所观察的。实施例2受病原应激的Arabidopsis植物防御素的整体诱导作用我们先前已经表明局部感染A.brassicicola可整体诱导小罗卜中的植物防御素基因(Terras等1995)。为研究是否在Arabidopsis中也有这种情况，我们通过ELISA(使用抗原亲和纯化的抗Rs-AFP1抗血清)和通过RNA凝胶印记分析(使用PDF1.2作为防御素的探针)分析了受A.brsssicicols感染的Arabidopsis叶片和被感染而未受处理的叶片(整体叶片)中的植物防御素的诱导作用。在蛋白质水平上，发现植物防御素从接种前取样时的检测限度(0.05微克/毫克总可溶性蛋白质)以下的量在接种72小时后病原处理和未处理的整体叶片中分别提高到高达10和3微克/毫克总可溶性蛋白质(图4A)。在病原处理的和未处理的整体叶片中接种后防御素mRNA稳定状态的水平均上升，并且接种后48小时在两种叶片样品中mRNA的量均达到最大(图4B)。实施例3化学品处理时Arabidopsis植物防御素的诱导作用直至最近所研究的受病原应激时被诱导的基因至少可能部分的受水杨酸(SA)或2,6-二氯异烟酸(INA)的诱导，后者是一种模拟水杨酸作用的合成化合物(Ward等，1991)。在Arabidopsis中，业已显示PR-1,PR-2和PR-3受SA和INA处理的强诱导(Uknes等)。然而，不管通过RNA印记分析还是通过ELISA的检测，SA或INA处理时均不能观察到植物防御素基因表达的诱导作用(图5)。相反，乙烯或甲基茉莉酸酯的应用，明显增加植物防御素基因的表达。在适当对照处理例如在空气中培育(乙烯的对照)或应用0.1％(v/v)乙醇(甲基茉莉酸酯的溶液对照)样品中没有检测到植物防御素基因表达的增加。Arabidopsis中PR蛋白质基因(PR-1,PR-2,PR-3)先前已显示出与乙烯处理无关(Lawton等，1994)。综合起来，这些数据表明植物防御素基因和PR-蛋白质基因被不同组的化学品所诱导。
化学品百草枯和玫瑰红也被测试了其对植物防御素基因表达的影响。用百草枯或玫瑰红处理植株已知分别导致活性氧化物过氧化物阴离子和单氧分子(Bowler等，1992；Green和Fluhr,1995)，并因此引起氧分压(oxidative stress)。植物防御素蛋白质和mRNA被百草枯或玫瑰红强诱导(图5)。
Arabidopsis叶片的损伤在处理后48小时检测时不导致可检测到水平的植物防御素mRNA(图5)。因为已知许多损伤诱导基因在处理后相对短的时间内被暂时打开(Berger等，1995；Warner等，1993)，我们通过RNA印记分析和ELISA还证实在损伤后3,6,9,12,24和48小时，植物防御素基因的表达。然而，在任何分析的时间点，不管损伤是通过用解剖刀制作切口还是用镊子夹碎叶片造成的(结果未出示)，都不能检测到植物防御素基因的表达。实施例4Arabidopsis中植物防御素的整体诱导遵循茉莉酸酯和/或乙烯依赖途径因为SA和INA不能诱导植物防御素的合成，我们进一步研究了SA在继真菌感染后的植物防御素诱导中的作用。因此，我们检测了在已知SA信号途径中被遗传修饰的Arabidopsis植株中植物防御素基因的表达。Npr突变株表现出阻断的SA信号途径，因为它在SA处理或病原感染时不能表达PR蛋白质基因(Cao等，1994)。相反，cpr突变株甚至在没有任何感染信号时SA和PR蛋白质水平就已不断上升。
用水模拟接种或用A.brasssicicola孢子悬液接种SA信号途径中受影响的不同Arabidopsis品系的植株，并在72小时后收集处理和未处理的叶片。通过RNA印记分析和ELISA检测植物防御素基因的表达。当用A.brassicicola接种野生型(Col-0)植株时，与模拟接种植株相应叶片比较，植物防御素基因的表达在病原处理和未处理的整体叶片均被诱导(图6)。在受到A.brassicicola侵染时npr1突变株和cpr1突变株植物防御素基因均同样被诱导，而且在模拟接种的cpr1植株中没有观察到组成型表达。实施例5诱导植物防御素的途径需要乙烯和茉莉酸酯反应途径中的成分如上所示，在应用外源性乙烯或甲基茉莉酸酯后，Arabidopsis叶片中有植物防御素积累。为弄清这两种植物激素在植物防御素诱导中的作用，我们研究了在乙烯不敏感突变株ein2和etr1-3(Guzman和Ecker,1990；Chang等，1993)以及花冠素和甲基茉莉酸酯不敏感型突变株coil(Feys等，1994)中植物防御素基因的表达。
植物防御素的诱导明显受乙烯不敏感型或茉莉酸酯不敏感型突变株的真菌感染的影响。在ein2和coil植株中植物防御素的表达似乎差不多完全被阻断。在用A.brassicicola接种后的ein2和coil植株被病原处理和未处理的整体叶片中植物防御素水平比类似病原处理的野生型植株样品相应叶片中的水平至少低30倍。在ein2和coil植株中病原诱导的植物防御素基因的表达的阻断可能发生在转录水平，因为在病原处理的植株叶片中没有检测到植物防御素mRNA。在etr1-3植株中，病原处理的叶片中植物防御素基因的表达被提高到类似于病原处理的野生型叶片中发现的水平。然而，在etr1-3植株的未处理的完整叶片中，植物防御素的积累被增加到比野生型植株整体叶片中的水平低3倍的水平。所述诱导作用在三个独立的实验中是一致的，但诱导程度不同。实施例6在损伤模拟突变株acd2中植物防御素被组成型诱导Arabidopsis acd2突变株自发产生类似于通过野生型植株经受烈性细菌侵染时产生的过敏反应所形成的损伤(Greenberg等1994)。由于该突变株先前已被显示在无症状和坏死叶片中均积累有高水平的PR蛋白质转录本，(Greenberg等，1994)，认为值得检测acd2植株中的植物防御素基因的表达。从5周龄的acd2植株分别收集健康无症状的上层莲座叶丛叶片和表现坏死的下层莲座叶丛叶片，以及从生长在同样条件下的野生型(Col-0)植株收集健康上层和下层莲座叶丛叶片。按照通过ELISA进行的检测，acd2植株积累了非常高水平的植物防御素，估计分别构成无症状叶片和有坏死损伤的叶片中总可溶性蛋白质的5％和10％(图8)。RNA印记分析显示与野生型植株中的水平比较，在acd2的坏死以及无症状叶片中植物防御素转录本水平被明显提高(图8A)。实施例7乙烯和茉莉酸酯通过等位信号途径激活PDF1.2基因通过乙烯反应受累突变株(ein2)和茉莉酸酯反应受累突变株(coil)阻断PDF1.2的病原诱导表达的观察提示乙烯和茉莉酸酯由于某种原因相互作用来影响该基因的表达。从概念上讲，能设想出三个乙烯和茉莉酸酯相互作用的模型(图10)。
第一个模型提示病原识别导致增加的乙烯生成，由此导致刺激茉莉酸酯的生成和随后的PDF1.2激活。第二个模型与第一个相同，不同的是乙烯和茉莉酸酯的信号之间的等级颠倒过来。最后，第三个模型假设乙烯和茉莉酸酯不以顺序的方式起作用，而是通过等位途径起作用，其中在病原识别时，两者均需要被激活以诱导PDF1.2基因。
先前已显示用Alternaria brassicicola接种Arabidopsis野生型植株(Col-0)导致叶片中茉莉酸酯水平上升(Penninckx等，1996)。第一个模型预言在病原感染时这种茉莉酸酯水平的上升不会发生在乙烯不敏感型突变株ein2中，然而，按照模型2和3,ein2突变不会影响病原刺激的茉莉酸酯途径。为测试这些相佐的预言，用病原A.brassicicola感染ein2和野生型植株(Col-0)，其后在不同时间监测茉莉酸酯水平。如图11所示，在真菌接种的野生型植株中茉莉酸酯水平在接种24小时后开始上升并从接种后48小时开始更加陡然上升在接种后约72小时达到峰值。在coil突变株中，病原刺激的生成作用很明显没有完全被取消，而甚至相对于野生型来说作用更明显。因此，这些结果与根据模型1产生的预言想矛盾。
为进一步甄别模型2和3，测量了由野生型植株和ciol突变株对A.brassicicola接种起反应时的乙烯生成作用。模型2预言在病原侵入时，coil突变株刺激乙烯生成的能力将被阻断，而模型3提示与野生型植株相比coil突变株中乙烯反应不被降低。用A.brassicicola接种野生型植株使乙烯生成水平为模拟接种植株中的约两倍，在接种后60小时达到峰值水平(图12)。乙烯生成水平类似的双倍增长还在A.brassicicols处理的coil突变植株中观察到(图12)。相对于野生型植株来说，接种和模拟接种的coil突变株中乙烯生成水平平均约高出两倍。鉴于coil突变株中病原刺激的乙烯生成作用明显没有被消除，所得结论是模型2不可靠。因此提出等位乙烯和茉莉酸酯信号途径的模型3是与全部观察相一致的唯一模型。
证实模型1的可靠性的另一个方式是用甲基茉莉酸酯处理野生型植株和ein2突变株并随后在处理两天后通过ELISA检测植物防御素水平。用50微摩尔甲基茉莉酸酯处理野生型植株使植物防御素水平比溶剂处理的野生型植株中的植物防御素高至少100倍。相反，用甲基茉莉酸酯处理的ein2突变株的植物防御素含量相对于溶剂处理的植株没有上升(图13)。这个观察与模型1相矛盾，该模型预言茉莉酸酯诱导PDF1.2的积累不受ein2突变的影响。
用甲基茉莉酸酯单独处理能激活PDF1.2基因的事实与模型3基本无矛盾，因为通过外部施用甲基茉莉酸酯处理植株导致促进乙烯的生成是牢固确立的(Crapski和Saniewski,1992)。用乙烯单独处理非无菌土壤生长的植株导致促进植物防御素的积累(参见实施例3)，这也明显与模型3不一致。然而，用乙烯单独(25ppm)处理生长在琼脂培养基上的无菌植株时，观察不到被诱导的PDF1.2积累(结果未示出)。用甲基茉莉酸酯处理无菌植株仍然诱导PDF1.2积累，最可能是由于同时刺激乙烯生成。乙烯刺激PDF1.2在非无菌植株中积累但在无菌植株中无此积累的观察可通过假设与土壤中微生物接触的植株改变它们对乙烯处理的反应性而得到解释。
应注意的是在考虑模型3是最可能的模型的同时，进一步的实验可显示出其他模型之一更可能是最好解释乙烯和茉莉酸酯之间相互作用的模型。实施例8Arabidopsis和烟草中茉莉酸酯和/或乙烯依赖型防御素途径的可记录标记基因的开发通过PCR方法，用基于PDF1.2cDNA序列的引物(基因库注册号T04323)克隆ArabidopsisPDF1.2基因启动子。该方法产生1616bp的基因组DNA片段的克隆，其序列被显示在图14。该基因组片段的序列位于1202-1296，并且1388-1616与源于位置1-326的PDF1.2cDNA序列恰好相配合。在位于1297-1387相对于所述cDNA序列的该基因组序列配对中的间断被认为代表着位于编码PDF1.2信号肽内部的91bp内含子。在预言的内含子剪接部位周围的序列与其他植物基因中所观察的同义(consensus)序列相一致。重要的是，该基因组序列含1201bp的cDNA5’序列和1232bp预期的PDF1.2基因产物的转录启始上游。然后设计实验来检测PDF1.2基因转录启始密码的5’DNA序列是否可能含有带调节元件的启动子，所述调节元件决定病原诱导的该基因局部和整体表达以及茉莉酸酯和其他化学品刺激的诱导作用，所述诱导作用将诱导PDF1.2基因产物的积累。为此目的，将包括推定的启动子元件连同5’非翻译先导序列和部分编码头七个PDF1.2密码子的区域在内的基因组片段的前1254bp作为翻译的融合区连接到Escherichia coli UidA基因的编码区(编码β-葡糖苷酸酶或GUS)，然后再搭接到Agrobacterium tumefaciens胭脂碱合成酶终止子(tNOS)上。所产生的pPDF1.2-GUS-tNOS表达盒被转移到植物转化载体内，通过基础(based)根转化法转化进入Arabidopsis thaliana生态型C24。
pPDF1.2-GUS-tNOS转基因对茉莉酸处理起反应的能力首先在六个独立的T0转基因ArRbidopsis品系的后代被检测到。使每个品系的种子在含1％蔗糖和50微摩尔卡那霉素的Skoog琼脂培养基或有10微摩尔茉莉酸补充的同样培养基上无菌发芽。发芽后10天收获幼苗用4甲基伞形酰基(umbelliferyl)葡糖苷酸做底物按照Jefforson的方法(1987)测定它们的β葡糖苷酸酶活性。β葡糖苷酸酶活性被标准化成每样品总蛋白质含量，如通过Bradford的方法(1976)使用牛血清白蛋白作为标准所确定的。
如表1所示，全部被测品系表现出在茉莉酸酯处理的幼苗中β葡糖苷酸酶活性相对于未受处理的幼苗有明显增加(范围从9到25倍)。品系19表现最强的相对茉莉酸酯诱导的β葡糖苷酸酶活性的增加，该品系通过自花受粉被进一步培育以得到转基因纯合的T3代种子。该品系被用于随后的所有分析中。表1在缺乏或有10微摩尔茉莉酸中发芽后，载有pPDF1.2-GUS-tN0S转基因的六个独立的Arabidopsis品系的10天龄幼苗中β葡糖苷酸酶活性<
>*在37℃每分钟和每毫克可溶性蛋白质时，以pmoles表示的从4-甲基伞形酰基(umbelliferyl)葡糖苷酸释放的4-甲基7羟香豆素通过RNA凝胶印记和ELISA检测显示，用真菌病原Alernoariabrassicicola接种Arabidopsis叶片时，PDF1.2基因被整体诱导。通过在继处理转基因植株后48小时接种和未接种整体叶片中测定β葡糖苷酸酶活性评估了对接种真菌病原Alternaria brassicicola和Botrytis cinerea产生反应的四周龄转基因Arabidopsis植株中pDF1.2-GUS-tNOS报导基因的表达。通过施加5微升液滴conidal孢子悬液(5×105孢子/毫升水)到下层莲座叶丛叶片上(每叶4滴)接种A.brassicicola。通过在下层莲座叶丛叶片的针刺伤口上覆盖5微升液滴的5×105孢子/毫升半加强马铃薯葡萄糖肉汤分生孢子1孢子悬液(Difco)接种B.cinerea(每叶4个伤口，每伤口1滴)。如图15所示，用A.brassicicols或B.cinerea接种后被接种的叶片和为被接种的整体叶片相对于模拟接种的叶片中β葡糖苷酸酶活性均明显提高。这表明pPDF1.2-GUS-tNOS报导基因是Arabidopsis整体病原诱导基因表达的适当标记。
用各种化学品处理四周龄的Arabidopsis pPDF1.2-GUS-tNOS转基因植株以研究其诱导所述报导基因表达的能力。在这些测试中使用的化学品是茉莉酸(JA,500微摩尔在0.1％乙醇中)，甲基茉莉酸酯(MeJA,50微摩尔在0.1％乙醇中)，水杨酸(SA,5毫摩尔水溶液)，2,6-二氯异烟酸(INA,1毫克/毫升水中)，1,2,3-苯并噻二唑-7-硫代羟酸S甲酯(BTH,300微摩尔水溶液)，百草枯(PQ,25微摩尔水溶液)。在植株完全展开的叶片上使用所述化学品溶液，以5微升液滴滴在上层叶片表面(每叶5滴)。分开的一组植株也通过在密封温室中接触乙烯(25ppm)被处理。在用化学品或适当对照处理48小时后，从处理过的植株收集叶片并测定β葡糖苷酸酶活性。
如图16所示，用JA,MeJA，或百草枯处理诱导了pPDF1.2-GUS-tNOS报导基因，而用SA,INA,BTH或乙烯则没有作用。这些发现进一步肯定基于PDF1.2基因在对化学品的处理(乙烯处理除外)的反应中的RNA凝胶印记分析和ELISA检测。虽然发现乙烯处理增加非无菌土壤生长的植株的PDF1.2水平(参见实施例3)，这种气体激素不启动无菌植株的PDF1.2的积累(参见实施例7)。因此，非无菌培养条件似乎增加Arabidopsis植株对乙烯的反应性。这种增加的反应性可能足以激活内源性PDF1,2基因，但不能激活pPDF1.2-GUS-tNOS镶嵌报道基因。
为证实SA,INA和BTH是否被用在诱导SA-依赖型病原诱导基因的条件下，还在携带包含Arabidopsis β-1,3-葡聚糖酶PR-2型基因(称为Bg12)启动子控制下的β葡糖苷酸酶编码区的镶嵌转基因的转基因植株上进行了上述测试(Bowling等，1994，植物细胞杂志第六期1485-1857页)。该转基因在下面被缩写为pBg12-GUS-tNOS。如图3所示，用SA和其功能类似物INA和BTH处理转基因pBg12-GUS-tNOS Arabidopsis植株确能导致明显增长的β葡糖苷酸酶活性，而JA,MeJA，乙烯或百草枯均没有任何影响。先前已经表明SA，INA和BTH诱导Arabidopsis中SA依赖型病原诱导基因，如PR-1,PR-2和PR-5(Uknes等，1992)。
总之，这些资料表明pPDF1.2-GUS-tNOS报导基因在没有SA介入时对病原感染有整体反应，从而表明它是SA非依赖型病原诱导基因激活的一个适当的可记录标记，并可能也是SA非依赖型诱导的抵抗力之适当的可记录标记。
为了测试pPDF1.2-GUS-tNOS启动子是否可被用做Arabidopsis以外植物中的SA非依赖型病原诱导基因表达的标记，还通过Agrobacterium介导的叶片转盘转化法将pPDF1.2-GUS-tNOS基因引入烟草栽培品种Xanthi-nc中。挑选T2代植株的转基因纯合子。用烟草花叶病毒接种恰在最嫩的完全展开之叶片下的叶片后，检测8周龄植株的转基因品系中整体病原诱导的表达。烟草栽培品种Xanthi-nc对烟草花叶病毒有抵抗力并通过产生过敏反应来抵抗病毒，因此防止病毒扩散到损伤以外。在接种后的2,4和6天分别收集最嫩的完全展开的叶片和位于最嫩的完全展开叶片之上的叶片，并测量β葡糖苷酸酶活性。通过在50毫摩尔磷酸钠缓冲液(pH7)，按每10毫升缓冲液1克组织研磨被烟草花叶病毒预感染的烟草栽培品种Hicks之叶片。该悬浮液10倍稀释于缓冲液中并通过金刚砂粉末研磨后施用在烟草叶片上。对照植株只用缓冲液和粉末模拟接种。如图17所示，取自接种后两天的被接种叶片和取自接种后4天的整体叶片中β葡糖苷酸酶活性明显增加。此外，通过水杨酸(SA,5毫摩尔水溶液)，甲基茉莉酸酯(MeJA,50毫摩尔0.1％乙醇溶液)，百草枯(PQ,25微摩尔水溶液)处理和通过损伤检测报导基因的诱导能力。按照在8周龄植株的完全展开的叶片上四液滴100微升来施用化学品。通过用有锯齿末端的镊子以2厘米的间隔捻碎叶片对损伤做测试。在被处理的叶片和适当的对照中测量处理后48小时的β葡糖苷酸酶的含量。
如图18所示，甲基茉莉酸酯和百草枯均引起β葡糖苷酸酶的高于35倍的增长。相反，损伤和水杨酸处理只导致活性的2倍增长。通过在以同样方式处理的烟草植株中进行的RNA凝胶印记分析证实烟草PR-1的激活作用表明(类似于Arabidopsis的情况)该基因只被水杨酸所诱导，而不被甲基茉莉酸酯，百草枯或损伤所诱导(未给出)。
这些结果表明PDF1.2启动子在烟草(一种属于Solanaceae科的植物)的SA非依赖途径中被激活，而在病原侵入时，它可在全部植株中被整体诱导。因此，pPDF1.2-GUS-tNOS报导基因可被用于不同植物达到筛选诱导SA非依赖型防御途径的化合物，微生物或物理损伤处理之目的。实施例9由乙烯和茉莉酸酯协同诱导植物防御素启动子我们的有关茉莉酸酯和乙烯通过等位途径激活PDF1.2基因的发现(参见实施例7)提示茉莉酸酯与乙烯的结合可具有对激活该基因的协同作用。为测试这个假说，将乙烯和甲基茉莉酸酯以其每种化合物单独不能激活转基因Arabidopsis报导植株中的pPDF1.2-GUS-tNOS基因的剂量相结合。如图19所示，用0.5微摩尔甲基茉莉酸酯液滴在含25ppm乙烯的大气中处理Arabidopsis叶片导致非常高的β葡糖苷酸酶活性，而每个单独的处理没有引起增加的β葡糖苷酸酶水平。当结合333微摩尔的乙烯磷(一种在喷洒到植物上时产生乙烯的化合物)和0.5微摩尔甲基茉莉酸酯结合时检测到明显的但低水平的协同作用(图19)。在该测试中，乙烯磷以比正常用于激活植物衰老过程的速率低10倍的速率被利用。
这些发现提示用分别激活乙烯反应途径和茉莉酸酯反应途径的化合物之混合物处理植株可导致更有效的刺激天然抵抗力抵抗特殊种类的病原。实施例10茉莉酸酯和/或乙烯依赖途径在Arabidopsis抵抗某些病原的防御中起重要作用为测试受茉莉酸酯和/或乙烯依赖型防御途径影响的Arabidopsis的病害易感性，开发出一种用于子囊菌死体营养真菌病原Botrytis cinerea(有性型=Botrytinia fuckeliana)的生物检测。该检测包括用Botrytis cinerea孢子悬液覆盖针刺伤口，然后检测被接种植株的死亡。图20显示用一系列野生型Arabidopsis植株(Col-0)，乙烯不敏感突变株(ein2)，和茉莉酸酯不敏感突变株(coil)组成的测试中死亡植株的数目。平均来说，全部接种的ein2突变株中41％和全部接种的coil突变株中86％在16天后死亡，与之对比，只有1％野生型植株死亡(图20)。继ein2和coil植株腐烂后有大量分生孢子形成。初步测试表明受水杨酸依赖型防御反应影响的突变株，npr1对Botrytis cinerea感染有如同Col-0野生型一样的抵抗力。这些结果指出茉莉酸酯和/或乙烯依赖型防御反应途径对建立Arabidopsis植株抵抗灰霉真菌Botrytis cinerea的抵抗力的重要性。
还用卵菌活体营养(biotrophic)真菌病原Peronosporaparasitica致病变型Wela进行对野生型(Col-0)和突变株npr1,ein2和coil的病害生物检测。通过使用乳酸酚/锥虫蓝染色的方法检测叶片中的真菌结构来检测该真菌造成的感染。这些实验显示Col-0,ein2和coil不支持任何可测得到的病原生长，而npr1突变株则被大量形成卵孢子的真菌菌丝严重感染(图21)。
总之这些数据表明本文所述茉莉酸酯和/或乙烯依赖型防御途径是成功防御Botrytis cinerea而非Peronospora parasitica感染倾向的一个关键决定因素，并且对水杨酸依赖型防御途径来说则正相反。因此，在植物中似乎至少两种有效抵抗完全不同类型病原的独特防御途径在起作用。重要的是，这个发现提示在用既诱导茉莉酸酯和/或乙烯依赖型防御途径又诱导水杨酸依赖型防御途径的化合物的混合物时，将实现一个光谱诱导抵抗力。
按照在乙烯不敏感和茉莉酸酯不敏感的Arabidopsis突变株所观察到的提高了的病害敏感性表型之推论，若在宿主防御某些病原时，茉莉酸酯和/或乙烯依赖型病原诱导的防御反应起主要作用，则可期望用激活这种反应途径的化合物处理植株可导致对某些病原的敏感性降低。
至少对B.cinerea，我们已经显示了至少Arabidopisis植株通过激活茉莉酸酯和/或乙烯依赖型基因而非水杨酸依赖型基因可建立起抵抗力，由此可以解释对这种病原，1,2,3-苯并噻二唑-7-硫代羟酸S甲酯所提供的防御作用的缺乏(Lawton等)。
几乎所有作物植物对一定范围而非一、二种病原微生物是敏感的。因此重要的是用于病害控制的化学品对尽可能广的病原谱提供抵抗力。在本文前部分我们已描述了称做茉莉酸酯和/或乙烯依赖型防御途径的未经证实的防御途径，所述防御途径不仅基本区别于已被深入研究的水杨酸依赖型防御途径而且也对另外通过激活水杨酸依赖型防御途径而被控制的特殊病原提供抵抗力。从这些观察可以推断通过用混合成分(cocktails)和既激活水杨酸依赖型防御途径又激活茉莉酸酯和/或乙烯防御途径的化合物处理植物可得到更广的病害控制谱。
对熟悉本专业领域的人员来说，显而易见本发明的其他修饰方法没有脱离本发明的范围。例如本发明的筛选还可被用于对植株进行化学，生物，微生物或物理处理所做的筛选，以导致对水杨酸非依赖型病虫害的抵抗力。参考文献Beffa,R.,Szell,M.,Meuwly,P.,Pay,A.,Vogeli-Lange,R.,Metraux,J.-P.,Neuhaos,G.,Meins,F.,Nagy,F.(1995).霍乱毒素提高烟草中的病原抵抗力并诱导致病相关基因的表达。EMBOJ14,5753-5761Bent,A.F.,Innes,R.W.,Ecker,J.R.,和Staskawicz,B.J.(1992).用烈性和非烈性Pseudomonas和Xanthononas病原感染的乙烯不敏感型Arabidopsis thaliana中病害的发展Berger,S.,Bell,E.,Sadka,A.，和Mullet,J.E.(1995).Arabidopsis thaliana Atvsp基因与大豆VspA和VspB基因同源，这些基因编码营养储存蛋白质酸性磷酸酶，并类似的受甲基茉莉酸酯，损伤，蔗糖，光可磷酸盐调节。Plant,Mol.Biol.27,933-942Bleecker,A.B.,Estelle,M.A.,Somerville,C.，和Kende,H.(1988).Arabidopsis thaliana中的一个显性突变所产生的对乙烯的不敏感性。Science 241,1086-1089.
Bowler,C.,Van Montagu,M.,和Inze,D.(1992).超氧化物歧化酶与应激耐受。Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.43,83-116Bowling,S.A.,Guo,A.,Cao,H.,Gordon,A.S.,Klessig,D.F.,和Dong,X.(1994).Arabidopsis中的一个突变导致整体获得的抵抗力的组成型表达。Plant Cell 6,1845-1857.
Bradford,M.M.(1976).利用蛋白质染料结合原理对蛋白质进行微克数量级定量的快速而敏感的方法。Anal.Biochem.72,248-254Brederode,F.T.,Linthorst,H.J.M.,和Bol,J.F.(1991).通过病毒感染，乙烯磷处理，紫外光和损伤差别诱导获得的抵抗力和PR基因的表达。Plant Mol.Biol.17,1117-1115.
Broekaert,W.F.,Terras,F.R.G.,Cammue,B.P.A.，和Vanderleyden,J.(1990).真菌生长的自动定量测定。FEMSMicrobiol.Lett.69,55,60.
Broekaert,W.F.,Terras,F.R.G.,Cammue,B.P.A.，和Osborn,R.(1995).植物防御素作为宿主防御系统的成分的新型抗微生物多肽。Plant Physio.108,1353-1358.
Cao,H.,Bowling,S.A.,Gordon,A.S.，和Dong,X.(1994).对整体获得的抵抗力诱导物不敏感的Arabidopsis突变株的特征。Cell 6,1583-1592。
Czapski和Saniewski(1992)J.Plant.Physiol.139,265-268Chang,C.,Kowk,S.F>,Bleecker,A.B.，和Meyerowitz,E.M.(1993).Arabidopsis乙烯反应基因etrl产物类似于双元调节子。Science 262,539-544.
Chen,Q,G.,和Bleecker,A.B.(1995).与野生型和突变型Arabidopsis中壳多糖酶的诱导以及幼苗生长反应有关的乙烯信号转导动力学分析Plant Physiol.108,597-607.
Cohen,Y.,Gisi,U.，和Nickerman,T.(1993).通过茉莉酸和茉莉酸甲酯诱导的局部和整体对Phytophthora infestans的防御作用。Phytopathol.83,1054-1062.
Delaney,T.P.,Uknes,S.,Vernooij,B.,Friedrich,L.,Weymann,K.,Negrotto,D.,Gaffney,T.,Gut-Rella,M.Kessmann,H.,Ward,E.,和Ryals,J.(1994).水杨酸在植物病害抵抗力中的中心作用。Science266,1247-1250.
Dellaporta,S.L.J.,Wood,J.,Hicks,J.B.(1983)植物DNA的微量制备第二版，Plant Molecular Biology Reporter 1:19-21Dempsey,D.M.A.,Wobbe,K.K.，和Klessig,D.F.(1993).Arabidopsis thaliana对萝卜皱叶病病毒的抵抗力和易感反应。Phytopathol.83,1021-1029.
Ditta,G.,Stanfield,S.,Corbin,D.,Helinski,D.R.(1980)。革兰氏阴性细菌的宽宿主范围DNA克隆系统根瘤菌草木犀基因库的构建。Proc.Natl.Acad.Sci.USA.12,7347-7351Doares,S.H.,Narwaez-Vasquez,j.,Conconi,A.，和Ryan,C.A.(1995).水杨酸抑制由systemin和茉莉酸诱导的西红柿叶片中蛋白酶抑制因子的合成。Plant Physiol.108,1741-1746
Ecker,J.R.，和Davis,R.W.(1987).植物防御基因受乙烯调节。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,5202-5206Ecker,J.R.(1995).植物中的乙烯信号转导途径。Science268,667-675Eggermont K.,Goderis I.J.,Broekaert W.F.(1996)以沙子和玻璃珠混合物中反复震摇匀浆方法为基础从植物样品高产率提取RNA。Plant Mol.Biol Rep.14,273-279Epple,P.,Apel,K.，和Boglmann,H.(1995).Arabidopsisthaliana的thionin基因可通过不同于致病相关蛋白质的信号转导途径诱导。Plant Physiol.109,813-820.
Feys,B.J.F.,Benedetti,C.E.,Penfold,C.N.,和Turner,J.G.(1994).筛选用于抵抗植物毒素花冠素的Arabidopsis突变株是雄性不育，对甲基茉莉酸酯不敏感，并抵抗细菌病原。Plant Cell 6,751-759.Friedrich等，(1996)Plant j.10,61-70.Gasch,A.,Aoyana,T.,Foster,R.和Chua,N-H.(1992).用世界科学出版公司，新加坡的C.Koncz,N-H Chua,J.Schell编辑的Arabidopsis研究一书中第342-356页的方法用聚合酶链反应分离基因。
Gorlach等(1996)Plant Cell,8,626-643.
Green,R.，和，R.(1995)。紫外B诱导的PR-1积累受活性氧物质的调节。Plant Cell 7,203-212Greenberg,J.T.,Guo,A.,K1essig,D.F.，和Ausubel,F.M.(1994).植株的程序化细胞死亡有多种防御功能协调激活的一种病原触发反应。Cell 77,551-563.
Guzman,P.，和Ecker,J.R.(1990).利用三重反应鉴别乙烯相关突变株。Plant Cell 2,513-523.
Heitz,T.,Fritig,B.，和Legrand,M.(1994).致病相关蛋白在受烟草花叶病毒感染的烟草植株中局部和整体的积累。Molec.Plant-Microbe Interact.7,776-779.
Horsch,R.B.,Fry,J.E.,Hoffmann,N.L.,Eichholtz,D.,Rogers,S.G.和Fraley R.T.(1985).传递基因进入植株中的一种简单而普通的方法。
Jefferson(1987)Plant Mol.Biol Rep.5,387-405.
Keogh等(1980),Trans.Br.Mycol.Soc 74,329-333Kessmann等，(1994)Annu.Rev.Phytopathol.32,439-349.
Kogel等，(1995)。Eur.J.Plant Phthol.101,319-332.
Lawton,K.,Weymann,K.,Friedrich,L.,Vernooij,B.,Uknes,S.，和Ryals,J.(1995).在Arabidopsis中整体获得抵抗力需要水杨酸,但不需要乙烯。Mol Plant-Microbe Interact.8,863-870.
Lawton,K.A.,Potter,S.L.,Uknes,S.，和Ryals,J.(1994).在Arabidopsis中获得抵抗力的信号转导作用是乙烯依赖性的。Plant Cell 6,581-588.
Lawton等(1996)Plant J.10,71-82Mauch,F.,Hadwiger,L.A.，和Boller,T.(1984).乙烯病原和诱导物诱导豌豆荚中壳多糖酶和β-1,3-葡聚糖酶的症状而非信号。Plant Physiol.76,607-61lMauch-Mani,B.，和Slusarenko,A.J.(1994).用Fusariumoxysporam病原分离物预处理感染诱导的Arabidopsis thaliana中整体获得的抵抗力。Mol.Plant-Microbe Interact.7,378-383Meins,F.Neuhaus,J.M.,Sperisen,C.，和Ryals,J.(1991).植物致病相关的葡聚糖水解酶极其基因的一级结构。与植物防御有关的基因，Tboller,F.Meins编辑(Springer Verlag,Berlin),pp245-282
Nairn,C.J.,Winsett,L.，和Ferl,R.J.(1988).Arabidopsishtaliana的肌动蛋白基因之核苷酸序列。Gene 65,247-257.
Pena-Cortes,H.,Albrecht,T.,Prat,S.,Weiler,E.W.，和Willmitzer,L.(1993).通过阻断茉莉酸生物合成，阿司匹林防止损伤诱导的西红柿叶片基因的表达。Planta 191,123-128Penninckx等(1996)Plant Cell 8,2309-2323.
Potter,S.,Uknes,S.,Lawton,K.,Winter,A.M.,Chandler,D.,Dimaio,J.,Novitzky,R.,Ward,E.，和Ryals,J.(1993).Arabidopsis中橡胶蛋白-样蛋白的调节作用。Mol.Plant-MicrobeInteract.6,680-681.
Sambrook,J.,Fritsch,E.F.，和Maniatis,T.(1989).分子克隆实验室手册。Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring,Harbor,NY.
Schaller,G.E.，和Bleecker,A.B.(1995).酵母表达的Arabidopsis ETR1基因中产生的乙烯结合部位。Science 270,1809-1811.
Schweizer等(1997)Plant Physiol.114,79-88.
Terras,F.R.G.,Schoofs,H.M.E.,De Bolle,M.F.C.,VanLeuven,F.,Rees,S.B.,Vanderleyden J.,Cammue,B.P.A.，和Broekaert,W.F.(1992).小萝卜(Raphanus sativus L.)种子的两个新类型的植物抗真菌蛋白的分析。J.Biol.Chem 267,15301-15309.
Terras,F.R.G.,Torrekens,S.,Van Leuven,F.,Osborn,R.W.,Vanderleyden,J.,Cammuue,B.P.A.，和Broekaert,W.F.(1993).源于Brassicaceae种的碱性胱氨酸丰富植物的抗真菌蛋白的新家族。FEBS Lett.316,233-240.
Terras,F.R.G.,Eggermont,K.,Kowalewa,V.,Raikhel,N.Y.,Osborn,R.W.,Kester,A.,Rees,S.B.,Torrekens,S.,Van Leuven,F.,Vanderleyden,J.,Cammuue,B.P.A.，和Broekaert,W.F.(1995).小萝卜的小抗真菌蛋白它们在宿主防御中的作用。Plant Cell 7,573-588.
Uknes,S.,Mauch-Mani,B.,Moyer,M.,Potter,S.,Williams,S.,Dincher,S.,Chandler,D.,Slusarenko,A.,Ward,E.，和Ryals,J.(1992).Arabidopsis中获得的抵抗力。Plant Cell 4,645-656.
Uknes,S.,Winter,A.,Delaney,T.,Vernooij,B.,Morse,A.,Friedrich,L.,Nye,G.,Potter,S.,Ward,E.，和Ryals,J.(1993).Arabidopssi中整体获得的抵抗力的生物诱导作用。Mol.Plant-Microbe Interact.6,692-698.
Valvekens,D.,van Montagu,M.和van Lij sebettens,M.,(1988)通过使用卡那霉素筛选进行Arabidopsis thaliana根移植物的Agrobacterium tumefaciens介导的转化。Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85,5536-5540.
Ward,E.R.,Uknes,S.L.,Williams,S.C.,Dincher,S.S.,Wiederhold,D.L.,Alexander,D.C.,Anl-Goy,P.,Metraux,J.-p.，和Ryals,J.(1991).与诱导整体获得的抵抗力的试剂有关的协调基因活性。Plant Cell 3,1085-1094.
White等，(1979)Virology,99,410-412.
权利要求
1．一种保护植物抵抗病原的方法，该方法包括通过刺激茉莉酸酯和/或乙烯途径诱导植物防御素基因的表达。
2．权利要求1的方法，其中植物防御素基因的表达或一种协调表达基因的表达被刺激茉莉酸酯和乙烯途径所诱导。
3．权利要求1或2的方法，其中病原是死体营养病原。
4．权利要求1到3任何之一的方法，其中病原是微生物病原。
5．前述权利要求中的任何之一的方法，其中病原是真菌病原。
6．前述权利要求中的任何之一的方法，其中所述途径被施加一种或一种以上的物质所刺激，所述物质是乙烯，茉莉酸酯或茉莉酸样化合物，模拟乙烯作用的试剂，模拟茉莉酸作用的试剂，非除草剂量的模拟乙烯作用的试剂，非除草剂量的模拟茉莉酸酯作用的试剂和引起氧化应激的试剂。
7．前述权利要求的任何之一的方法，其中茉莉酸酯和/或乙烯途径的刺激涉及Arabidopsis的信号转导成分EIN2和COI1。
8．通过给植物施用一种或一种以上的乙烯，茉莉酸酯，模拟乙烯或茉莉酸酯作用的试剂和引起氧化应激的试剂诱导植物防御素基因表达的方法。
9．权利要求7或权利要求8的方法，其中能引起氧化力的试剂是产生超氧化物阴离子的双酚除草剂如百草枯或杀草快或导致产生单氧物质的玫瑰红或酸性曙红。
10．能诱导植物防御素基因表达的组合物，包括一种或一种以上的茉莉酸，茉莉酸酯，乙烯，模拟乙烯或茉莉酸酯作用的试剂和引起氧化应激的试剂。
11．能诱导植物防御素基因表达的组合物，包括一种或一种以上的产生乙烯化合物，脂质衍生的信号分子，水杨酸，水杨酸的功能类似物和产生活性氧的化合物。
12．权利要求11的组合物，其中产生乙烯的化合物选自乙烯，乙烯磷和氨基环丙烷羧酸。
13．权利要求11或权利要求12的组合物，其中脂质衍生的信号分子选自花生四烯酸及其衍生物，亚麻酸及其衍生物和茉莉酸酯及其衍生物。
14．权利要求11到13的任何一种组合物，其中活性氧产生的化合物选自百草枯，杀草快，玫瑰红和酸性曙红。
15．筛选用于诱导抵抗力活性之化合物的方法，该方法包括给植物或植物的部位施用被怀疑提供这种抵抗力的化合物并检测植物防御素基因或协同表达的基因之表达。
16．权利要求15的方法，其中所述病原是死体营养病原。
17．权利要求15或权利要求16的方法，其中所述病原是微生物病原。
18．权利要求15到17任何之一的方法，其中所述病原是真菌。
19．权利要求15到18的任何之一的方法，其中所述植物是小萝卜，烟草或Arabidopsis．
20．权利要求19的方法，其中所述植物是Arabidopsis，并且所述防御素是植物防御素基因PDF1.2的产物(图14)，一种与PDF1.2有基本同源性的序列或其变异序列。
21．权利要求15到20任何之一的方法，其中所述化合物被用于叶片。
22．权利要求15到21任何之一的方法，其中通过使用PDF1.1或PDF1.2基因产物的抗体进行检测。
23．能诱导植物防御素基因表达的启动子，包括被茉莉酸或模拟其作用的试剂和/或乙烯或模拟其作用的试剂所诱导的区域。
24．被包含在图14所显示的核酸序列中的启动子区，或与图14所显示的核酸序列有基本同源性的序列，或其变异序列。
25．基本上如前面参考任何图示之一所描述的方法，组合物和启动子。
全文摘要
描述一种保护植物抵抗病原的方法,该方法包括通过刺激茉莉酸酯和/或乙烯途径诱导植物预防基因的表达。本文还描述了一种诱导植物防御基因的方法,一种能诱导植物防御基因表达的组合物和一种筛选有抵抗力诱导活性之化合物的方法。优选病原是死体营养的病原。
文档编号G01N33/68GK1224334SQ9719607
公开日1999年7月28日 申请日期1997年6月20日 优先权日1997年6月20日
发明者W·F·布罗克尔特, B·P·H·J·托马, I·A·M·A·彭宁克斯, F·R·G·特拉斯, J·M·曼纳斯, K·卡詹 申请人:曾尼卡有限公司