专利名称：：一种专用启动子及培育抗病转基因植物的方法
技术领域：
：本发明涉及一种专用启动子及培育抗病转基因植物的方法。
背景技术：
：小麦纹枯病又称小麦尖眼斑病(wheatsharpeyespot)是危害我国小麦生产的重要病害，主要由禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)CAG-I引起(陈延熙，唐文华，张敦华，简小磨·Apreliminarystudyonetiologyofsharpeye-spotofwheatinChina.植物保护学报1986，13(1):39-44)。纹枯病破坏小麦的茎秆部韧皮部组织，不仅造成植株易倒伏，营养物质运输不畅，使种子干瘪，甚至引起枯白穗，造成减产。纹枯病一般可使小麦减产10%-30%，严重地块减产50%以上，甚至颗粒无收。加之近年来小麦生产水平的不断提高，耕作制度的改变，以及全球变暖等因素的影响，使小麦纹枯病呈逐年上升的趋势(史Μ^δΦriitSi,·PathogenicityofRhizoctoniacerealistowheatinJiangsuprovince.江苏农业学报，1997，13(3)188-190)。根据全国农业技术推广总站报道，2005-2008年，我国每年遭受小麦纹枯病危害的麦田面积大约在670-800万公顷，经济损失在十亿元以上(赵美琦，魏开锋，毕可政.Studiesontheepidemicpredictionofwheatsharpeyespot.植物保护学报，1997，24(4)=303-308)0培育并应用抗纹枯病小麦新品种无疑是控制该病害最经济和最有效的途径。易于利用的抗病小麦种质与抗病基因是抗病育种的首要条件。国内学者对近千份小麦材料进行抗病性鉴定中，没有发现对纹枯病免疫的小麦品种(系)，高抗的材料匮乏(史建荣，王裕中，陈怀谷，沈素文.小麦纹枯病品种抗性鉴定技术及抗病资源的筛选与分析.植物保护学报，2000，27(2)107-112；杨立军，杨小军，喻大昭，王绍南.Resistanceevaluationofwheatcultivars(lines)toRhizoctoniacerealisVarderHoevenandscreeningofitsresistanceresources.植物保护，2001,27(2):4_7;万映秀，王文相，张平治，曹文昕，赵莉·IdentificationTechniquesandScreeningofSharpEyespotResistanceofWheat.中国农学通报，2009，25(7):223_226)。对一些小麦纹枯病抗源的抗性遗传分析和抗病性状位点分析结果表明，小麦纹枯病抗性是由主基因和微效基因共同作用的数量性状，并且存在复杂的基因互作(张小村，李斯深，赵新华，李瑞军.GeneticAnalysisonResistancetoSharpEyespotbyUsingFifteenPopulationsofRecombinantInbredLinesinWheat.麦类作物学报，2004，24(3):13_16;汤颜，任丽娟，蔡士宾，吴纪中，陆维忠，陈建民，马鸿翔.StudyonQTLmappingofsharpeyespotresistance(Rhizoctoniacerealis)inwheatARz.麦类作物学报,2004，24(4):11_16；蔡士宾,任丽娟,颜伟,吴纪中，陈怀谷,吴小有,张仙义.Germplasmdevelopmentandmappingofresistancetosharpeyespot(Rhizoctoniacerealis)inwheat.中国农业禾斗学，2006,39(5):928-934)。小麦对纹枯病抗性的复杂遗传方式，使得常规育种的周期长、预见性差等，直接影响了小麦纹枯病抗性改良的进度。转基因工程由于周期短、针对性强等优点，已经成为提高作物抗病能力的新手段。如中国农业科学院作物科学研究所张增艳课题，分离克隆出病原诱导的中间偃麦草ERF转录因子TiERFl基因，证明其为可与GCC-Box顺式元件结合的激活型ERF转录因子(LimgHX,LuYiLiuHXiWangFDiXinZY,ZhangZY.Anovelactivator-typeERFofThinopyrumintermedium，TiERFl,positivelyregulatesdefenceresponses.JournalofExperimentalBotany，2008，59(11):3111_3120)o米用转基因技术，将TiERFl基因和抗菌肽Rs-AFP2等基因导入小麦推广品种扬麦12中，获得了纹枯病抗性提高的转基因小麦新种质(ChenLimg，ZhmgZeng_Ym，LimgHong-XiaiLiuHong-Xia,DuLi_Pu，XuHui-Jun,XinZhi-Yong.OverexpressionofTiERFlenhancesresistancetosharpeyespotintransgenicwheat.JournalofExperimentalBotany,2008,59(15)4195-4204；路妍，张增艳，任丽娟，刘宝业，廖勇，徐惠君，杜丽璞，马鸿翔，任正隆，井金学，辛志勇.MolecularAnalysesonRs_AFP2TransgenicWheatPlantsandTheirResistancetoRhizoctonicIcerenl，2009，35(4):640_646)。目前，在转基因技术中所使用的启动子大多数为组成型表达启动子，如在双子叶转基因植物中使用花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，在单子叶植物中主要使用玉米泛素ubiquitin和水稻肌动蛋白actin等启动子。这些组成型表达启动子调控的基因表达不受时空限制和外界环境的诱导，即在植物所有组织中均过量表达目的基因产物，其结果会造成转基因植物体内物质和能量的无谓浪费，引起一些副作用。如张增艳课题通过基因枪法获得了转Ubi:=TiERFl基因的扬麦12阳性植株，证明TiERFl过表达可以提高小麦对纹枯病的抗性(ChenLiang,ZhangZeng-Yan,LiangHong-Xia,LiuHong-Xia,DuLi-Pu,XuHui-Jun,XinZhi-Yong.OverexpressionofTiERFlenhancesresistancetosharpeyespotintransgenicwheat.JournalofExperimentalBotany,2008,59(15):4195-4204)。但是AP2/ERF转录因子超表达在提高转基因植株耐逆性的同时，还会产生生长迟缓、植株矮化、产量下降等不良影响(阳文龙，刘敬梅，刘强，公衍道，赵南明.IsolationandcharacterizationofaDREB-Iiketranscriptionfactorgenefromtallfescue.核农学报，2006，20(3)187-192)。
发明内容本发明的目的是提供一种专用启动子及培育抗病转基因植物的方法。本发明提供的DNA分子，为如下⑴或⑵或(3)所述的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA杂交且具有启动子功能的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA至少具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。所述严格条件为在0.IXSSPE(或0.1XSSC)、0.1%SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。含有所述启动子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组载体具体可为如下⑴或(II)或(III)(I)将pAHC20质粒的SphI和BglII酶切位点之间的小片段替换为序列1所示DNA分子得到的重组质粒；(II)将pAHC20质粒的SphI和BglII酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列1所示DNA分子，BamHI和SacI酶切位点之间的小片段替换为TiERFl蛋白的编码基因得到的重组质粒(重组质粒的SphI和BamHI酶切位点之间为序列表的序列2所示的启动子)；(III)用限制性内切酶BglII与BamHI双酶切pAHC20载体，回收小片段；用限制性切酶BamHI酶切重组质粒甲，回收载体骨架；将所述载体骨架和所述小片段连接得到的重组质粒；所述重组质粒甲为将序列表的序列1所示的DNA分子插入到pAHC20载体质粒的HindIII和BamHI位点之间得到的重组质粒；所述TiERFl蛋白的氨基酸序列为如下(a)或(b)(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗性相关的由序列4衍生的蛋白质。所述TiERFl蛋白的编码基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列3所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子。所述严格条件为在0.IXSSPE(或0.1XSSC)、0.1%SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。本发明提供的培育转基因植物的方法，包括如下步骤将所述启动子和由所述启动子驱动的所述TiERFl蛋白的编码基因导入出发植物中，得到抗病性强于所述出发植物的转基因植物。所述启动子和所述TiERFl蛋白的编码基因具体可通过重组质粒pA20-Ubi::TiERFl导入所述出发植物。所述重组质粒pA20_EnRSSlP:TiERFl是在pAHC20质粒的多克隆位点插入所述启动子和所述TiERFl蛋白的编码基因得到的重组质粒。所述重组质粒pA20-EnRSSlP:TiERFl优选为将pAHC20质粒的SphI和BglII酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列1所示DNA分子，BamHI和SacI酶切位点之间的小片段替换为TiERFl蛋白的编码基因得到的重组质粒(重组质粒的SphI和BamHI酶切位点之间为序列表的序列2所示的启动子)。所述出发植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦(如扬麦12)。所述抗病可为抗小麦纹枯病。所述小麦纹枯病具体可为由禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)引起的小麦纹枯病。所述抗病具体可为抗禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)引起的病害。本发明提供了一种增强型水稻蔗糖合酶基因启动子(EnRSSlP)，为组织特异性启动子。转基因植物的启动子可以分为组成型启动子和组织特异性启动子两大类。组成型启动子驱动的外源基因在转基因植物的所有时期和组织中均可表达，造成了能量的浪费。所以，对于组织特异性启动子的研究和应用正日益受到广大转基因育种者的重视。组织特异性启动子不仅可以诱导外源基因在转基因植株的特异组织进行表达，而且还可以通过其含有的诱导表达元件，在植株的不同时期或不同条件下进行表达，从而避免了能量的浪费，保证植株的能量更多的进行产量性状的积累，还对转基因植物的食品安全性问题有重要的意义。本发明还构建了用EnRSSlP驱动TiERFl基因组织特异表达的重组质粒PA20-EnRSSlP:TiERFl0重组质粒中不含有bar基因，从而克服了bar基因存在对环境安全影响的可能性。利用基因枪轰击法将该重组质粒转入小麦，获得了不仅对纹枯病抗性增强且农艺性状不受影响的转基因小麦。用本发明的启动子驱动TiERFl基因表达，不仅可有效地防治小麦纹枯病等根、茎部病害，而且可解决转基因小麦籽粒的食用安全性问题。Ubi启动子诱导的转基因小麦则由于其组成型表达特性，使转基因小麦在株高等方面发生了一些不良变化，而用本发明的启动子驱动TiERFl基因表达，并不影响受体小麦品种的基本特性，进一步说明组织特异型启动子EnRSSlP在转基因育种方面相对于组成型启动子有更多的优势。因此，EnRSSlP应用于基因工程，可更有效地防治小麦纹枯病等根、茎部病害，具有重要的实用价值。图1为实施例中pA20-EnRSSlP:TIERFl载体的构建示意图。图2为⑶S基因的染色结果。图3为部分T1代植株的PCR鉴定；WT为扬麦12(阴性对照)，P为重组质粒PA20-EnRSSlPTiERFlB(阳性对照)，1-15为T1代植株，其中4为RSTI-3株系、5为RSTI-39株系、6为RSTI-62株系、7为RSTI-124株系、13为RSTI-127株系。图4为半定量RT-PCR分析转基因小麦T1代不同组织和扬麦12中TiERFl的表达量。图5为荧光定量PCR检测转基因小麦T1代不同组织和扬麦12中TiERFl的相对表达量。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。水稻品种“日本晴”种子购自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库。小麦品种扬麦12购自江苏里下河农业科学研究所。小麦纹枯病致病菌为禾谷丝核菌(lihizoctoniacerealis)购自江苏省农业科学院。pAHC20质粒ChristensenAH,QuailPH.Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch，1996，5:213_2180实施例1、组织特异型启动子RSSlP的克隆根据现有水稻蔗糖合酶基因5'末端序列设计一对特异性引物(RSS1P-F1和RSS1P-R1)，靶序列为5'末端非编码区上游序列(1715bp)0RSSlP-Fl5'-CTCCTTCATTTTCAGTGCAAATGTG-3‘；RSSlP-Rl5'-CCAATGGTGGTCAGAGACGAG-3‘。按照改良的CTAB法提取水稻品种“日本晴”幼叶的基因组DNA。以基因组DNA为模板，用特异性引物(RSS1P-F1/RSS1P-P1)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增采用TaqplusDNA聚合酶(Takara)；反应参数为94°C预变性5min；94°Clmin,58°Clmin，72°C3min，循环30次；72°C后延伸IOmin0PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶回收纯化，克隆于载体PMDlS-T(Takara)，得到质粒pMD18_RSSlP，送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。测序结果表明，在载体pMDIS-T中插入了序列表的序列1所示的外源DNA，将序列1所示DNA命名为RSSIP。实施例2、重组表达载体(pA20_EnRSSlP:TiERFl)的构建和增强型RSSlP(EnRSSlP)的获得一、重组表达载体pA20_EnRSSlP:TiERFl的构建如图1所示构建重组表达载体pA20-EnRSSlP:TiERFl。1、按照改良的CTAB法(MurrayMG,ThompsonWF.RapidisolationofhighmolecularweightplantDNA.NucleicAcidsResearch,1980,8(19):4321-4325)提取水稻品种“日本晴”幼叶的基因组DNA。2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用RSS1P-F2/RSS1P-R2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。RSS1P-F25'-AGA|GCATGC|CTCCTTCATTTTCAGTGCAAATG-3‘(框中为SphI识别序列)；RSS1P-R25‘-ATA|GGATCC|CCAATGGTGGTCAGAGAC-3‘(框中为BamHI识别序列)。3、用限制性内切酶SphI和BamHI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物(约1720bp)。4、用限制性内切酶SphI和BglII双酶切PAHC20质粒，回收骨架载体(约4130bp)。5、将步骤3的酶切产物和步骤4的骨架载体用T4连接酶进行连接(3摩尔酶切产物1摩尔骨架载体)，得到重组质粒，将重组质粒进行测序。测序结果表明，得到了重组质粒PA20-EnRSSlP:bar，其骨架载体为pAHC20，将SphI和BglII酶切位点之间的Ubi启动子，替换为了序列表的序列1所示的RSS1P，RSSlP与Ubi的Exon和htron序列构成了长为2787bp的增强型RSSlP(EnRSSlP)。EnRSSlP的核苷酸序列见序列表的序列2。6、合成TiERFl基因(TiERFl基因的核苷酸序列如序列表的序列3所示的，编码序列表的序列4表示的TiERFl蛋白)。7、以步骤6合成的TiERFl基因为模板，用TiERFl-F/TiERFl-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。TiERFl-F5‘-TTCIgGATCCIATGCTGCTGAACCCGGCC-3‘(框中为BamHI识别序8列)；TiERFl-R5'-TCT|GAGCTC|CTAGCTGACCAGCTGCTG-3‘(框中为SacI识别序列)。8、用限制性内切酶BamHI和I双酶切步骤7的PCR扩增产物，回收酶切产物(约89Ibp)。9、用限制性内切酶BamHI和&icI双酶切重组质粒pA20_EnRSSlP::bar，回收去除bar的载体骨架(约537^ρ)。10、将步骤8的酶切产物和步骤9的载体骨架连接(3摩尔酶切产物1摩尔骨架载体)，得到重组质粒，将重组质粒进行测序，测序结果表明，得到了重组质粒pA20-EnRSSlP:TiERFl(约6260bp)，其骨架载体为pAHC20质粒，在SphI和BamHI酶切位点之间为序列表的序列2所示的EnRSSlP，在BamHI和McI酶切位点之间为序列表的序列3所示的TiERFl基因；EnRSSlP启动子控制TiERFl基因表达。二、重组表达载体pA20_Ubi:TiERFl的构建1、合成TiERFl基因(TiERFl基因的核苷酸序列如序列表的序列3所示的，编码序列表的序列4所示的TiERFl蛋白)。2、以步骤1合成的TiERFl基因为模板，用TiERFl_F/TiERFl_R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。3、用限制性内切酶BamHI和I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物(约89Ibp)。4、用限制性内切酶BamHI和I双酶切pAHC20质粒，回收载体骨架。5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架用T4连接酶进行连接(3摩尔酶切产物1摩尔骨架载体)，得到重组质粒，将重组质粒进行测序。测序结果表明，得到了重组质粒pA20-UbiTiERFl(骨架载体为pAHC20质粒，在BamHI和McI酶切位点之间为序列表的序列3所示的TiERFl基因Wbi启动子控制TiERFl基因表达)。实施例3、RSS1P、EnRSSlP和Ubi启动子的活性比较一、重组质粒的制备pAHC20质粒中具有Ubi启动子驱动的⑶S基因表达盒。合成序列表的序列1所示的RSS1P。将RSSlP插入到pAHC20载体质粒的HindIII和BamHI位点之间，得到重组质粒甲(pRsslp:OTQ。重组质粒甲中，RSSlP启动⑶S基因的表达。用限制性内切酶BglII与BamHI双酶切pAHC20载体，回收小片段(UBI-INTR0N片段)；用限制性切酶BamHI酶切重组质粒甲，回收大片段(载体骨架)；将所述大片段和所述小片段连接，得到重组质粒乙(p&iRsslp::OTQ。重组质粒乙中，EnRSSlP启动⑶S基因的表达。二、瞬时表达实验利用徐惠君等(XuH_J(徐惠君)，PangJ_L(庞俊兰)，YeX-G(叶兴国)，DuL-P(杜丽璞)，LiL-C(李连城)，XinZ-Y(辛志勇)，MaY-Z(马有志)，ChenJ-P(陈剑平)，ChenJ(陈炯)，ChengS-H(程顺和)，恥Y-H(吴宏亚)·StudyonthegenetransferringofNib8intowheatforit'sresistancetotheyellowmosaicvirusbybombardment.ActaAgronomicasinca(作物学报)，2001,27:684-689(inChinese9withEnglishabstract))报道的基因枪轰击法将重组质粒(重组质粒甲、重组质粒乙或PAHC20质粒)转入扬麦12的幼胚愈伤组织，72小时后进行GUS基因的染色。结果见表1和图2。表IGUS基因的染色的染色结果权利要求1.DNA分子，为如下⑴或⑵或(3)所述的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA杂交且具有启动子功能的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA至少具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。2.含有所述启动子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为如下(I)或(II)或(III)(I)将PAHC20质粒的SphI和BglII酶切位点之间的小片段替换为序列1所示DNA分子得到的重组质粒；(II)将PAHC20质粒的SphI和BglII酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列1所示DNA分子，BamHI和SacI酶切位点之间的小片段替换为TiERFl蛋白的编码基因得到的重组质粒；(III)用限制性内切酶BglII与BamHI双酶切pAHC20载体，回收小片段；用限制性切酶BamHI酶切重组质粒甲，回收载体骨架；将所述载体骨架和所述小片段连接得到的重组质粒；所述重组质粒甲为将序列表的序列1所示的DNA分子插入到pAHC20载体质粒的HindIII和BamHI位点之间得到的重组质粒；所述TiERFl蛋白为如下(a)或(b)(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗性相关的由序列4衍生的蛋白质。4.如权利要求3的(II)所述的重组质粒，其特征在于所述TiERFl蛋白的编码基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列3所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子。5.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤将启动子和由所述启动子驱动的TiERFl蛋白的编码基因导入出发植物中，得到抗病性强于所述出发植物的转基因植物；所述启动子为序列表的序列2所示的DNA；所述TiERFl蛋白为如下(a)或(b)(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗性相关的由序列4衍生的蛋白质。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述TiERFl蛋白的编码基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列3所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物抗性相关蛋白的DNA分子。7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述启动子和所述TiERFl蛋白的编码基因通过重组质粒pA20-Ubi:TiERFl导入所述出发植物；所述重组质粒pA20-EnRSSlP:TiERFl是在pAHC20质粒的多克隆位点插入所述启动子和所述TiERFl蛋白的编码基因得到的重组质粒；所述重组质粒pA20-EnRSSlP:TiERFl优选为将pAHC20质粒的SphI和BglII酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列1所示DNA分子，BamHI和SacI酶切位点之间的小片段替换为所述TiERFl蛋白的编码基因得到的重组质粒。8.如权利要求5至7中任一所述的方法，其特征在于所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物优选为小麦。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述抗病为抗小麦纹枯病；所述小麦纹枯病具体为由禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)引起的小麦纹枯病。10.如权利要求5至8中任一所述的方法，其特征在于所述抗病为抗禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)弓I起的病害。全文摘要本发明公开了一种专用启动子及培育抗病转基因植物的方法。本发明提供的启动子为序列表中序列2所示的DNA分子。本发明提供的方法是所述启动子和TiERF1蛋白的编码基因导入出发植物中，用所述启动子启动所述TiERF1蛋白的编码基因表达，得到抗病性强于所述出发植物的转基因植物；所述TiERF1蛋白的氨基酸序列如序列表的序列4所示。本发明的方法获得的转基因小麦不仅可获得对纹枯病抗性增强且农艺性状不受影响，具有重要的实用价值。文档编号C12N1/19GK102154295SQ20111002976公开日2011年8月17日申请日期2011年1月27日优先权日2011年1月27日发明者庄洪涛,张增艳,徐惠君,李钊,杜丽璞申请人:中国农业科学院作物科学研究所