br>[0018]如图1-3所示，图1为原有方法制作的对照物，组织微粒由于厚度大染色深，细胞膜结构不明显；图2本发明制作的对照物的局部展示，微切片因厚度与组织切片厚度一致，细胞膜阳性显示清晰；图3为待测阳性样本组织切片，免疫组化细胞膜阳性情况，将原有未切片组织微粒对照物、本发明组织切片微粒(微切片)与待测阳性样本切片免疫组化细胞膜阳性的比较，可以明显的得出，本发明石蜡包埋组织细胞切片微粒悬液对照物膜阳性及组织结构明显，大大地改善了观察者的感官效果。
[0019]实施例2:石蜡包埋细胞系切片对照悬液的制备方法如下:
其对照物为细胞系，培养Her2 3+、Her2 2+、Her2 1+的细胞系公认的已知阳性的细胞提取单细胞与微粒，在10%中性福尔马林固定，离心洗去福尔马林，或石蜡包埋切片后按实施例I的方法制成对照物，由于细胞系相对固定，可商品化，来源稳定，便于标准化。
[0020]实施例3:石蜡包埋实体瘤切片对照悬液的制备方法如下:
其对照物为用肿瘤种植的实体瘤作为阳性对照物的组织来源。用某种特定抗原表达瘤细胞对裸鼠进行种植，获取实体瘤，进行瘤组织处理，按实施例1的制备方法制作为石蜡包埋切片微粒及福尔马林处理单细胞及组织微粒，来源稳定，便于标准化。
[0021]实施例4:石蜡包埋阳性组织冰冻切片对照悬液的制备方法如下:
其对照物为阳性组织冰冻切片。对选取组织或培养后离心沉积的细胞沉积物进行冰冻切片切后用福尔马林固定，离心洗去福尔马林等操作方法同前，按实施例1的制备方法制作为阳性组织冰冻切片。
[0022]本发明的石蜡包埋不同对照物切片对照悬液作用对照物的应用
，对照物在对免疫组化等原位组织检测染色过程中作为对照物使用时，可进行多种组合，如可进行切片微粒/单细胞与非切片组织微粒/单细胞或培养细胞组合、可进行点涂物内部或外部组合，按需进行以减少对照物的种类，增加对照物的特异性。
[0023]作为对照物的运用方法如下:在对组织进行免疫组化、原位杂交等组织切片时将对照物悬液点滴、涂敷与待测样品旁，待测样品亦可以是细胞片，以后的步骤按待测样品需要检测的操作步骤进行即可，如免疫组化或原位杂交。观察待测样品，组织片或细胞片时，先观察对照物，阳性及阴性成分结果是否正确，阳性部位，膜阳性、浆阳性、核阳性是否正确，阳性强度如何。如果对照物结果正确，即可观察待查样品片结果，确定结果的阳性或阴性。在确定阳性强度时，由于对照物进行过与待测组织样品同样厚度的切片处理，如果已知阳性强度的对照物阳性程度变化，可以此调整待查片阳性强度的结果。对已知对照物结不正确时要寻找原因，是否少加某一步试剂，是否加错了主要试剂(如一抗)，是否抗体已失效。在新购主要试剂，如一抗时要已知阳性阴性的对照物进行检测是否可靠。
【主权项】
1.石蜡包埋对照物悬液的制备方法，其特征在于包括如下步骤: 1)石蜡包埋对照物切片脱蜡进行免疫组化、原位杂交等，观察切片中某种细胞丰富的成分，确定那些抗体阳性、核酸扩增或异常的对照物蜡块，对照切片修去不需要的组织备用； 2)选定步骤I)得到的对照物蜡块，按常规免疫组化、原位杂交组织切片厚度进行切片，便于用于组织切片免疫组化、原位杂交染色观察时保持同样的组织厚度，连续切完组织，将切下来的对照物切片移入不会被有机溶剂溶解的容器中备用； 3)向步骤2)的容器中加入能够溶解石蜡的溶剂，离心洗涤3次，除去不溶于水的溶剂，再加入梯度酒精离心处理，通过震荡、切割搅拌、超声波或移液器吸头破碎对照物切片，100-300 μ m过滤，得到对照物切片碎肩，有水化及不水化两种处理，梯度酒精按高浓度到低浓度的顺序； 4)不水化处理:将步骤3)得到的对照物切片碎肩加入低浓度酒精保存，依据点涂器具的不同及实际效果调整组织碎肩大小及浓度； 5)水化处理:将步骤3)得到的对照物切片碎肩彻底水化，加入蒸馏水或PBS或TBS缓冲液冲洗，离心沉积，将沉积物用能用于抗原保存的液体按体积比为1:1-3的比例稀释。
2.根据权利要求1所述的石蜡包埋对照物悬液的制备方法，其特征在于所述的对照物包括组织切片、细胞系、实体瘤或阳性组织冰冻切片。
3.根据权利要求1所述的石蜡包埋对照物悬液的制备方法，其特征在于步骤2)中的切片厚度为3-4微米。
4.根据权利要求1所述的石蜡包埋对照物悬液的制备方法，其特征在于步骤2)中容器为离心管。
5.根据权利要求1所述的石蜡包埋对照物悬液的制备方法，其特征在于步骤2)中在切片前将对照物蜡块用利器划成0.2-3mm的组织片。
6.根据权利要求1所述的石蜡包埋对照物悬液的制备方法，其特征在于步骤3)中所述的溶剂为纯净二甲苯或石油醚。
7.一种根据权利要求1所述的石蜡包埋对照物悬液在对免疫组化等原位组织检测染色过程中作为对照物的应用。
8.根据权利要求7所述的石蜡包埋对照物悬液的应用，其特征在于在对免疫组化等使用时，能采用多种组合对照。
9.根据权利要求8所述的石蜡包埋对照物悬液的应用，其特征在于组合对照包括:切片微粒/单细胞与非切片组织微粒/单细胞或培养细胞组合、点涂物内部或外部组合。
10.根据权利要求7所述的石蜡包埋对照物悬液的应用，其特征在于方法如下:在将对照物进行免疫组化、原位杂交等对照物切片时将对照物悬液点滴、涂敷与待测样品旁，待测样品为组织片或细胞片时，先观察对照物，阳性及阴性成分结果是否正确，阳性部位，膜阳性、浆阳性、核阳性是否正确、阳性强度如何: 1)对照物结果正确，再观察待查样品片结果，确定结果的阳性或阴性； 2)在确定阳性强度时，由于对照物进行过与待测组织样品同样厚度的切片处理，已知阳性强度的对照物阳性程度变化时，以此调整待查片阳性强度的结果； 3)对已知对照物结果不正确时要寻找原因，是否少加某一步试剂、是否加错了主要试剂、是否抗体已失效。
【专利摘要】石蜡包埋对照物悬液的制备方法及应用，属于生物医学技术领域。它主要包括以下步骤：石蜡包埋切片确定有对照价值的组织蜡块，按免疫组化、原位杂交组织切片厚度切片，收集进入容器中；脱蜡、清洗后处理得到切片碎屑或微切片；经不水化或水化处理后，保存备用，其对照物可来自不同的组织等，对照时可选用多种组合，可进行点涂物内部或外部组合，可减少对照物的种类，增加其利用价值，增加了对照物的特异性，将其用于石蜡切片的免疫组化、特殊染色、原位杂交等染色作为质控对照物时，不仅使用方便，而且与切片对照时其厚度基本相同，参照对比更为可靠，可大大地改变观察者的视觉感官，尤其是细胞膜、浆阳性的结构及组织的结构更为清晰。
【IPC分类】G01N1-36, G01N33-531
【公开号】CN104655475
【申请号】CN201510062783
【发明人】丁伟, 任兴昌
【申请人】丁伟, 任兴昌
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月6日