术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 and Third edition，2001;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John ffiley&Sons, New York,1987 and periodic updates； the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego ；ffolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego,1998 ；METH0DS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, Chromatin(P. M. ffassarman and A. P. ffolffe, eds.), Academic Press，San Diego，1999;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，V〇1.119, Chromatin Protocols (P. B. Becker，ed. ) Humana Press，Totowa，1999 等。
[0045] 实施例1本发明试纸卡的制备
[0046] 1)使用预处理缓冲液对金标垫进行预处理，预处理缓冲液为：18_冠醚_66mg/ml 氯化钠0. 3mg/ml，甘氨酸2. 0mg/ml的水溶液，pH = 7. 4,预处理的具体步骤为：将金标垫在 预处理液中浸泡2h，取出放于37°C烘干；然后用胶体金标记的Abeam?Anti-C Reactive Protein antibody [CRP135]溶液喷涂经预处理的金标垫，制得包被Abeam?Anti-C Reactive Protein antibody[CRP135]的金标垫，溶液中胶体金与单克隆抗体的质量比为 5:1，溶液的浓度为10mg/ml，喷涂量为4ul/cm ;
[0047] 2)在硝酸纤维素膜的检测线（检测线T1和检测线T2)和质控线上分别喷涂 lmg/ml 的Abeam?.Anti-C Reactive Protein antibody[CRP_8](abl3426)溶液和羊抗鼠 IgG (购自MAXMED LABORATORIES INC.)溶液，喷涂量为lul/cm，制得包被后的硝酸纤维素 膜；
[0048] 3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴 在PVC底板上，切裁制得宽3-5mm的检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂 盒。
[0049] 实施例2对比试剂盒的制备
[0050] 对比例试纸卡的制备：采用25mM甘氨酸缓冲液预处理金标垫，其他试剂及实验方 法均同实施例1。
[0051] 1)采用25mM甘氨酸缓冲液预处理金标垫，然后用胶体金标记的Abeam?Anti-C Reactive Protein antibody[CRP135]溶液喷涂经预处理的金标垫，制得包被Abeam? Anti-C Reactive Protein antibody [CRP135]的金标垫，溶液中胶体金与单克隆抗体的质 量比为5:1，溶液的浓度为10mg/ml，喷涂量为4ul/cm ;
[0052] 2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂lmg/ml的Abcam?_Anti-C Reactive Protein antibody[CRP135]溶液和羊抗鼠IgG溶液，喷涂量为lul/cm，制得包被 后的硝酸纤维素膜；
[0053] 3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴 在PVC底板上，切裁制得宽3-5mm的检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂 盒。
[0054] 实施例3检测试剂盒的灵敏度实验
[0055] 取实施例1制得的C反应蛋白胶体金检测试剂盒，将试剂盒放置在水平台面上，分 别检测 〇? 5pg/ml、0. 8pg/ml、l. 0pg/ml、2pg/ml、5pg/ml、10pg/ml、20pg/ml、50pg/ml、100pg/ ml、200pg/ml、300pg/ml、400pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml 的 C 反应蛋白标准品，每个浓度重 复5次，以0pg/ml作为空白对照。用吸管吸取样品液2-3滴加入到样品槽中，在滴加样品 后8-15分钟判读结果。用金标读数仪对试剂盒检测线上的显色结果进行判读定量分析。以 C反应蛋白浓度为横坐标，金标读数仪检测信号（每个样品的检测结果为检测线T1和检测 线T2显色结果的平均值，每个浓度的检测结果为该浓度下5个样品的平均值）为纵坐标， 建立标准曲线。在标准曲线上，随着标准品浓度的升高，测得的信号值也随之升高。
[0056] 根据标准曲线计算可知，本试剂盒对0.5pg/ml、0. 8pg/ml的样品可以部分检出， 对1. 0pg/ml的样品全部检出，其最低检出限< 1. 0pg/ml，并在5-1000pg/ml的范围具有良 好的线性，T线颜色的深浅与样品中CRP浓度成正比。
[0057] 各浓度的批内最大CVs为4.9%，平均CVs为3.8% (每个浓度的样品同批进行测 试），各浓度的批间最大CVs为5. 3%，平均CVs为4. 6% (每个浓度的样品分5批进行测 试）表明本发明所提供的试剂盒具有良好的重复性。
[0058] 选择未检测出C反应蛋白的小牛血清进行加标回收实验，加入C反应蛋白标准 品，将 C 反应蛋白的浓度分别调整至 20pg/ml、100pg/ml、300pg/ml、500pg/ml、800pg/ml，空 白对照及每个浓度的样品均重复测定5次。各浓度的批内最大CVs为4. 6%，平均CVs为 3. 9%，各浓度的加标回收率为97. 9% -99. 8%，表明本发明所提供的试剂盒具有良好的准 确度。
[0059] 取实施例2的检测试剂盒进行灵敏度测试得知，实施例2的检测试剂盒灵敏度为 ^ 50pg/ml〇
[0060] 实施例4检测试剂盒的稳定性实验
[0061] 试剂盒的稳定性实验
[0062] 1?实验目的：
[0063] 将C反应蛋白胶体金检测试剂盒密封保存，并存放于4°C及室温（25°C左右）下， 观察不同存放温度对试剂盒稳定性的影响。
[0064] 2?实验方法：
[0065] 保存于4°C的试剂盒每周取出4盒，分别检测0?8pg/ml、l. 0pg/ml、l. 2pg/ml、 1. 6pg/ml的C反应蛋白标准品；保存于室温（25°C )的试剂盒每3天取出4盒，分别检测 0? 8pg/ml、l. 0pg/ml、l. 2pg/ml、l. 6pg/ml 的 C 反应蛋白标准品。
[0066] 3?实验结果：
[0067] 经验证，试纸盒在4°C下可保存20个月，在室温下可保存16个月；在可保存的期 限内，试剂盒均可达到l.〇pg/ml的检测灵敏度。
[0068] 综上所述，本发明所提供的检测试剂盒具有很好的灵敏性，阴性本底更低，有效克 服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0069] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因 此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种C反应蛋白胶体金检测试剂盒，包括试纸卡，试纸卡包括底板、及位于底板表面 的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述金标垫上包含胶 体金标记的抗C反应蛋白单克隆抗体-1，所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线。2. 如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上，检测线 位于离加样端较近一侧，质控线位于离加样端较远一侧。3. 如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述检测线包括检测线Tl和 检测线T2,所述检测线上包被有抗C反应蛋白单克隆抗体-2。4. 如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，质控线上包被有羊抗鼠IgG。5. 如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述样品垫采用缓冲液处理， 所述缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷 酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为50~lOOmM。6. 如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述金标垫采用缓冲液处理， 所述缓冲液选自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合，缓冲 液的浓度为10~40mM。7. 根据权利要求6所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液中还包括NaCl 和冠酿，所述冠酿选自二环已基-18-冠-6、15-冠酿-5、18-冠酿-6中的一种或多种的组 合，NaCl在缓冲液中的浓度为0.l-20mg/ml，冠醚在缓冲液中的浓度为0.l-20mg/ml。8. 如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，还包括卡壳，所述卡壳包括背 卡和上盖，所述背卡设有试纸卡卡槽，所述试纸卡嵌于所述试纸卡卡槽内，所述上盖设有测 试窗和加样孔，所述测试窗的位置与所述检测线和质控线的位置相配合，所述加样孔的位 置与所述样品垫的位置相配合。9. 如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒用于检测样 品中的C反应蛋白，所述样品选自人全血、血清或血浆中的一种或多种的组合。10. 根据权利要求1~9任一权利要求所述的胶体金检测试剂盒的制备方法，具体包括 如下步骤： 1) 用胶体金标记的抗C反应蛋白单克隆抗体-1溶液喷涂经预处理的金标垫，制得包含 抗C反应蛋白单克隆抗体-1的金标垫； 2) 在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂抗C反应蛋白单克隆抗体-2及羊抗 鼠IgG，制得包被后的硝酸纤维素膜； 3) 将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在底 板上，切裁制得检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。
【专利摘要】本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种C反应蛋白胶体金检测试剂盒及其制备方法和用途。本发明提供一种C反应蛋白胶体金检测试剂盒，包括试纸卡，试纸卡包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述金标垫上包含胶体金标记的抗C反应蛋白单克隆抗体-1，所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线。本发明所提供的C反应蛋白胶体金检测试剂盒兼具灵敏性和特异性，具有操作快速简便、结果准确、经济适用等优点。
【IPC分类】G01N33/532, G01N33/558, G01N33/68
【公开号】CN104897905
【申请号】CN201510292250
【发明人】李林, 翟志青
【申请人】上海凯创生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月1日