一种安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种安徽地方猪种肉质性状候选基因的 筛选方法。
【背景技术】
[0002] 随生活水平提高、营养观念的转变，人们对猪肉品质的要求越来越高，目前提高猪 肉品质成为生猪生产中的首要任务。过去的几十年间，生猪产业迎合市场需求，致力于瘦肉 型商品猪的高效生产，使商品猪生长周期越来越短，瘦肉产量也不断增加；但随之而来的是 猪肉肉质变劣，猪肉口感下降，比如：粗糙、缺乏肉的风味和香味。这是长期以来片面追求生 长速度快和瘦肉率尚所致，而在猪肉品质改善、提尚以及肉质性状遗传基础等方面缺少关 注，这一问题已受到各国学者的广泛关注。
[0003] 我国地方猪种具有优良的肉质特性，利用地方猪种培育和生产优质风味猪肉是我 国近年来生猪生产发展的一个主要方向。在国内的一些大中城市，优质风味猪肉越来越多 地受到广大消费者的欢迎。在大中城市超市的货架上，土猪肉即便价格上调20%以上，仍供 不应求。因此对我国地方猪种肉质特性进行更深入的研宄，可对我国地方猪种肉质特性有 更深刻、更全面的认识。
[0004] 现有相关研宄已明确，猪肉质性状数属于数量性状，主要由多种基因控制，随着分 子生物学技术的发展，可以筛选出控制肉质性状的候选基因，对肉质性状相关候选基因的 研宄已成为目前研宄热点。相关研宄成果可为地方猪种质资源特性和肉质性状研宄提供分 子生物学参考。也可为我国地方猪种合理开发利用及优质肉猪配套系和新品种培育提供理 论依据和技术支撑。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种效果理想、成本低、操作简便的安徽地方猪 种肉质性状候选基因的筛选方法。
[0006] 一种安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，包括如下步骤：
[0007] (1)对照动物模型的选择：选择安徽地方猪种圩猪、安庆六白猪与外来猪种大白 猪为研宄肉质品种差异的对照动物模型；
[0008] (2)样品采集：猪屠宰后，取背最长肌、心脏及肝脏组织；
[0009] (3)常规肉质指标测定：白度色度计测定眼肌肉色、pH计检测背最长肌屠宰存储1 小时及24小时后pH值、宰后即用嫩度仪检测背最长肌剪切力；
[0010] (4)采用色谱法测定背最长肌样品中IMP含量；
[0011] (5)采用索氏抽提法测定背最长肌样品中MF含量；
[0012] (6)采用RT-PCR的方法比较MP和MF形成过程中关键基因 ADSL、 GARS-AIRS-GART和DGATUDECR1 mRNA在猪肝脏、心脏和背最长肌组织中的表达水平，并进 行数据的统计分析，研宄此四种基因在不同猪种和组织中的表达规律及其与各肉质指标的 相关性。
[0013] 本发明所述的安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，其中，步骤（1)中所 述圩猪为21头10月龄圩猪、所述安庆六白猪为13头10月龄安庆六白猪，所述长白猪为6 头6月龄长白猪。
[0014] 本发明所述的安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，其中，步骤（2)中所 述样品采集为：21头10月龄圩猪、13头10月龄安庆六白猪及6头6月龄长白猪屠宰后，① 取背最长肌组织若干，于4°C保存，用于肉质常规指标及頂F、MP含量测定；②取背最长肌、 肝脏和心脏组织各l〇〇g，液氮冷冻，后转移至-80°C冰箱保存，用于基因表达检测。
[0015] 本发明所述的安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，其中，步骤（3)具体 包括如下步骤：
[0016] 肉色的测定：屠宰后立即测量，采用白度色度计测定眼肌肉色，读取L*值、a*值和 b*值，其中L*值表示亮度，取值0-100,值越大，亮度越大，L*大于53为灰白肉即异质肉； a*值是度量肌肉从红色到绿色的变化，a值越大肉质越好；b*值是度量肌肉从黄色到蓝色 的变化，b值越小肉质越好；根据所测的L*、a*和b*值判断肉色的差别；所述测定眼肌肉色 为测定背最长肌在胸腰椎结合处横截切面的肉色；
[0017] pH值的测定：屠宰后1小时测量，将pH电极直接插入所取背最长肌样品的中部， 深度不小于lcm，将电极头部完全包埋在肉样中，待数值稳定后，读取pH值，精确到0.01 ;将 肉样置于0-4°C冰箱中保存24h后，按照相同方法测pH值，所读取的数值即为pH24h;
[0018] 嫩度的测定：屠宰后立即测量，用剪切力表示，在肌肉中心插入温度计，放在保鲜 袋中，然后放入温度为72°C的水中蒸煮，当肉中心温度达到70°C时取出，冷却至室温后，将 肉样按与肌纤维呈垂直的方向切取宽度为I. 5cm的肉块，再用直径为I. 27cm圆形的取样 器，顺肌纤维方向钻切肉样块，置于嫩度仪中测其剪切力，每个样品做10个重复，记录剪切 力值，计算算术平均数，单位用牛顿（N)表示。
[0019] 本发明所述的安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，其中，步骤（4)具体 包括如下步骤：
[0020] 样品前处理：
[0021] 于屠宰后I. 5h内迅速采集背最长肌组织作为猪肉样品，当冷藏时间达到24h时， 取出猪肉样品制备肌苷酸测定样，使用绞肉机绞碎所述猪肉样品，准确称取5g，精确到 0.0001，置于50ml塑料离心管中，加入20ml 6%高氯酸，用高速组织匀浆机匀浆；匀浆液以 8000r/min离心15min，过滤到100mL的三角瓶中，将沉淀物用15ml 6%高氯酸再次勾衆，离 心，合并两次上清液，用5. Omol/L和0· 5mol/L NaOH调pH至6. 5,转移至100mL容量瓶中， 定容摇勾，测定前用〇. 45 μ m滤膜过滤后用于HPLC分析；
[0022] 色谱条件：
[0023] 色谱柱：Agilent 1100dC18 柱，5 μ m，Φ4. 6mmX 150mm ;流动相：50mmol/L ρΗ6· 5 甲酸铵缓冲溶液，其中含有5%甲醇；流速;柱温：25°C ;进样量：5yL ;紫外检测 波长：254nm ;运行时间：标准工作液运行4min，样品提取液运行llmin。
[0024] 本发明所述的安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，其中，步骤（6)中 ADSL的引物对的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2K*，GARS-AIRS-GART 的引物对的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示，DGATl的引物对的 核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示，DECRl的引物对的核苷酸序列 如序列表中SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示；荧光定量PCR扩增反应体系为25yL:SYBR Premix Ex TaqTMII 12.5 μ L，上下游引物各 1 μ L，引物浓度为 10 μ M/mL，cDNA 2 μ L，CldH2O 高压8. 5yL;反应条件为：95°C预变性2min;95°C 10s，60°C 45s，72°C延伸15s，收集荧光 值，40个循环。
[0025] 本发明所述的安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法，其中，数据统计分析 包括如下步骤：
[0026] 基因的表达量分析：用2-Λ ACt法对有效性数据进行统计学分析，目的基因的相 对表达量为2^ACT，Λ ACt表示选择β-actin为内参基因 ，以对照组目标基因与内标基因 的Ct差值平均值做为参照值，X表示任意一样本，公式如下：
[0027] Δ Δ Ct (Ct. Target gene ^ t. β -actin^ x ^ t. Target gene ^ t. β-actin^ control
[0028] 上述公式计算了每一个样本目标基因的表达量，通过内参β-actin基因校正后， 数据用平均值土标准误，即M±SE表示；采用SPSS19. 0软件对实验数据结果进行统计学分 析，均值差异显著性用One-way ANOVA程序进行分析比较，数据相关性分析采用Bivariate correlation程序进行分析。
[0029] 本发明安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法与现有技术不同之处在于：
[0030] 现有的报道对于安徽地方猪种与外来猪种肉质差异性的比较研宄较少，剪切力， 肉色，pH值，MP和MF均是肉质的重要指标，本发明所述安徽地方猪种肉质性状候选基因 的筛选方法通过对安徽省著名地方猪种安庆六白猪、圩猪与外来猪种长白猪的肉质性状进 行对比分析，可有助于深入了解不同品猪种肉质性状差异的原因；ADSL和GARS-AIRS-GART 为与肌苷酸含量相关候选基因，DGATl和DECRl基因是与脂肪沉积相关候选基因，通过对这 些基因在不同品种猪和组织中的表达研宄，可为进一步研宄猪品种间肉质性状差异的分子 遗传机制提供基础数据。
[0031] 本发明方法以安徽地方猪种圩猪、安庆六白猪以及国外瘦肉型猪种长白猪为研宄 对象，采用相关方法测定三猪种的各项肉质指标，研宄分析该3猪种品种间背最长肌肌苷 酸和肌内脂肪含量以及相关肉质指标的差异，采用定量PCR法比较ADSUGARS-AIRS-GART、 DGATl和DECRl基因 mRNA在肝脏、心脏和背最长肌组织中的表达水平，探讨此四种基因在不 同猪种和组织中的表达规律及其与各肉质指标的相关性，研宄结果可为地方猪种合理开发 利用及优质肉猪配套系（新品种）培育提供理论依据和技术支撑。
[0032] 下面结合附图对本发明的安徽地方猪种肉质性状候选基因的筛选方法作进一步 说明。
【附图说明】
[0033] 图1为本发明中不同猪种背最长肌肉色差异，注：图中不同大写字母表示差异极 显著（P〈0.01)，不同小写字母表示差异显著（P〈0.05);
[0034] 图2为本发明中不同猪种背最长肌pH值的差异，注：图中不同大写字母表示差异 极显著（P〈〇.〇l)，不同小写字母表示差异显著（p〈0.05);
[0035] 图3为本