一种血小板跨膜电位检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及输血医学领域，具体地说，设及一种血小板跨膜电位检测方法。
【背景技术】
[0002] 血小板是血液成分之一，在止血、凝血W及宿主免疫方面发挥着重要作用。血小板 没有细胞核，直径约2~3ym。正常血液中血小板的数量大约为150~400XIcyVL在体 内的最长寿命约为8~10天。
[0003] 随着输血医学的发展，血小板制品输注已成为临床输血治疗的重要手段，用于预 防和缓解血小板减少症或者功能障碍。但临床上常发生因非免疫因素导致的血小板输注无 效，如发热、感染、药物、血小板制品的质量等均可能影响血小板输注效果。血小板的形态、 活化、代谢W及调亡与血小板输注的治疗效果存在密切的联系。血小板在采集、储存、输注 的过程中受到各种因素刺激产生的储存损伤，导致血小板结构与功能的改变。血小板的储 存可能导致血小板部分被活化W及代谢功能的丧失，影响血小板的聚集活性和粘附能力。 血小板在体外保存期间的活化损伤即血小板储存损伤决定着血小板制品的质量。正确快速 评估血小板储存损伤对于指导采供血机构和临床医疗机构规范操作，规避血小板制品储存 损伤，降低血小板输注无效的发生频率，提高输血疗效，节约有限的血液资源来说是十分必 要的。
[0004] 目前评估血小板保存质量的相关检测指标有血小板计数、平均体积、形态学积分、 pH、血小板聚集活性、低渗休克率、CD6化和磯醋酷丝氨酸（P巧表达等，主要检测血小板形 态学及血小板功能的变化。尚未见对血小板生物电能改变的检测。在正常生理情况下细胞 内环境的各种成分和理化性质只在很小的范围内发生变动，即存在一个内环境的稳态。在 内、外环境因素的刺激作用下细胞内环境稳态失衡，在此基础上才出现各种病理生理变化。 血小板没有细胞核，因而极其脆弱，离体条件下非常容易被破坏。血小板在体外保存过程 中由于多种因素在体外容易被活化，该个过程中可能造成血小板内环境生物电能稳态的失 衡，表现为血小板跨膜电位的变化。因而跨膜电位的变化是血小板活化损伤的最初、第一步 的反应。第一时间观察血小板的生物电能的失衡，即血小板跨膜电位的测量，比其他方法能 更及时快速地了解血小板生理变化，及早预判可能的血小板储存损伤，尽早调配血液资源， 尽量减少血小板输注无效的发生，提高血小板临床输注安全。血小板膜电位变化的监控可 作为目前常用的血小板形态和功能监测方法的一个补充。
[0005] 目前膜电位检测方法如下：
[000引 1.电压错（Voltage-clamp)是由英国学者化xl巧和Katz最先应用的。其实质 是通过负反馈微电流放大器在兴奋性细胞膜上外加电流，保持细胞跨膜电位不变，并迅速 控制其数值，W观察在不同膜电位条件下膜电流的情况。膜电流的改变反映了膜电阻和膜 电容的变化，因此电压错可用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道的活动。 但该技术由于在细胞内插入两根电极，对细胞损伤很大，在小细胞中难W实现，又因细胞形 态复杂，很难保持细胞膜各处生物特性的一致，而逐渐被膜片错所取代。
[0007] 2.膜片错技术（Patch-clamp)是在电压错基础上发展起来一种新技术，与电压错 的主要区别有二：一是错制膜电位的方法不同；二是电位固定的细胞膜面积不同，即所研 究的离子通道数目不同。与电压错一样，膜片错也是利用负反馈电子线路，将微电极尖端所 吸附的一个至几个平方微米的细胞膜电位固定在一定水平，观察流过通道的离子电流。其 实现膜电位固定的关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻封接，使电极尖开 口处与相接的细胞膜小区域（膜片）形成无论是从机械上还是电学上都极为紧密地封接， 从而可反映细胞上单一（或多数）离子通道的分子活动。
[0008] 3.电压敏感染料也称为巧光探针，按照染料对膜电位变化的反应速度可W分为慢 反应电压敏感染料和快反应电压敏感染料。慢反应染料被称为Nernstian染料，对细胞膜 有通透性，细胞被染色时，染料可渗入细胞膜双脂质层。当细胞膜超极化时，染料与膜成分 相结合，膜表面染料浓度下降，出现消光效应，膜表面巧光减弱；反之，当细胞膜去极化时， 染料又重新被释放至膜表面，膜表面染料浓度增加，膜表面巧光增强。在细胞膜两侧电位 差的影响下，该些电压敏感巧光染料在胞外染色缓冲液和细胞质之间的分布服从能斯特方 程，据此可计算出细胞膜两侧电位差即跨膜电位的大小。
[0009]目前测定细胞跨膜电位较为经典的方法是微电极或者膜片错技术，但是用膜片错 测量如此微小血小板的跨膜电位需要专业的技术设备和较高的技术要求且费时费力，成本 较高，不利于对血小板跨膜电位及其变化做出快速的检测。利用电压敏感染料的跨膜电位 光学标测技术与传统的微电极等方法相比，具有动态测量电传导、不受大电场干扰等独特 的优势，受到了广泛关注。然而，用电压敏感染料检测膜电位时，分光光度计检测的是总的 巧光强度，可能会受到细胞总数的影响，且只能相对定量，检测灵敏度不高。此外，将血小板 膜电位变化的监控作为血小板形态和功能监测方法，则要求对于血小板破坏较少，具备较 好的实验重复性，方能达到准确预判可能的血小板储存损伤，提高血小板临床输注安全的 目的。
[0010] 综上所述，亟需一种检测灵敏度高、对血小板破坏少且实验重复性好的血小板跨 膜电位检测方法。但是目前关于该类方法还未见报道。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种血小板跨膜电位检测方法。
[0012] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0013] 一种血小板跨膜电位检测方法，所述的方法包括W下步骤：
[0014]a)血小板原液样品离屯、，弃上清，洗漆；
[0015]b)取部分经步骤a)处理的血小板样品，使用含0. 8-5mmol/L氯化巧且氯化钟含量 为l-6mmol/L的Hepes-Tyrodesbuffer重新悬浮血小板，稀释血小板至5~10X109/L，加 入流式管，记为F;另取部分经步骤a)处理的血小板样品，使用氯化钟含量为120-150mmol/ L的化pes-Tyrodesbuffer重新悬浮血小板，稀释血小板至5~10X 加入流式管， 记为F。；
[0016]C)向F。流式管中加入终浓度为0. 1-5 y g/L的短菌杆肤溶液，使细胞完全去极化；
[0017]d)向F和F。流式管加入终浓度为10-200nmol/LDiBAC4(3)溶液，轻轻震荡，混匀， 暗室室温染色15-60min;
[001引e)流式上机检测；
[0019] 根据修正后的能斯特方程；V=Edye=-(RT/Z巧*ln(F/F。)，计算血小板跨膜电位， 其中，F。代表细胞完全去极化时的巧光值，F代表细胞处于静息状态下的巧光值。
[0020] 优选地，步骤d)中DiBAC4做终浓度为80-100nmol/L，步骤C)中短菌杆肤终浓度 为 0.5-2yg/L。
[0021] 更优选地，步骤d)中DiBAC4 (3)终浓度为lOOnmol/l，步骤C)中短菌杆肤终浓度 为 1yg/L。
[002引优选地，步骤d)中染色时间为15-22min。
[0023] 更优选地，步骤d)中染色时间为20min。
[0024] 优选地，步骤b)中，记为F的血小板样品重新悬浮所用的化pes-Tyrodesbuffer 中氯化钟含量为l-5mmol/L，记为F。的血小板样品重新悬浮所用的化pes-Tyrodesbuffer 中氯化钟含量为120-140mmol/L。
[00巧]更优选地，步骤b)中，记为F的血小板样品重新悬浮所用的化pes-Tyrodes buffer中氯化钟含量为2. 7mmol/l，记为F。的血小板样品重新悬浮所用的化pes-Tyrodes buffer中氯化钟含量为137mmol/L。
[0026] 优选地，步骤b)中，记为F的血小板样品重新悬浮所用的化pes-Tyrodesbuffer 中氯化巧含量为0. 8-3mmol/L。
[0027] 更优选地，步骤b)中，记为F的血小板样品重新悬浮所用的化pes-Tyrodes buffer中氯化巧含量为1. 8mmol/L〇
[0028] 作为本发明的一种【具体实施方式】，所述的氯化钟含量为l-6mmol/L的 Hepes-Tyrodesbuffer具体含有W下浓度的试剂；137mmol/L氯化钢、2. 7mmol/L氯化钟、 12mmol/L碳酸氨钢、Immol/L氯化儀、0. 4mmol/L磯酸二氨钢、5. 5mmol/L葡萄糖、lOmmol/L Hepes，抑为 7. 4。
[0029] 需要说明的是，Ifepes-Tyrodesbuffer为本领域技术人员所熟知的缓冲液，本领 域技术人员应知晓，其各成分的浓度可W有细微的变化。
[0030] 流式细胞仪的使用对于本领域技术人员来说是熟知的，作为本发明的一种具体实 施方式，流式细胞仪检测参数为；电压设置；FSC;E-1;SSC;313 ;FL1 ;555 ;FL2 ;150 ;FL3 ; 150。但不仅限于此，本领域技术人员可根据实际情况进行合理的调整。
[0031] 修正后的能斯特方程；V=Edye= -(RT/Z巧*ln(F/F。）中，R代表通用气体常数，T 代表绝对温度，Z代表染料所带的电荷。
[0032] 如本文所用，"室温"是指本领域熟知的温度范围，较佳地是20-30°C。
[003引本发明优点在于：
[0034] 1、本发明对保存期间血小板跨膜电位的变化进行了观察，为血小板质量监控提供 一个不同的角度和思路，作为方法学的补充，充实了目前常用的形态学和功能学方法来评 估血小板体外保存质量，能通过第一时间观察血小板的生物电能的失衡，更及时快速地了 解血小板生理变化，及早预判可能的血小板储存损伤，尽早调配血液资源，尽量减少血小板 输注无效的发生，提高血小板临床输注安全。
[0035] 2、本发明结合了流式细胞仪技术，能够获得一定数量细胞的平均巧光强度，且为 绝对巧光强度的值，通过计算可W直接获得跨膜电位mV数值，而且还能得到细胞中不同状 态细胞的跨膜电位信息，检测灵敏度高。