一种基于γH2AX的细胞DNA损伤检测方法
【技术领域】
[0002] 本发明设及细胞DNA损伤标志物丫肥AX的检测方法，并将其用于卷烟烟气中化合 物的基因毒性检测，具体说是一种基于丫肥AX的细胞DNA损伤检测方法。
【背景技术】
[0003] 严重的细胞DNA损伤主要出现于W下几种情况；1)细胞在物理、化学或生物等因 素作用下直接诱导或是通过复制压力诱导形成的双链断裂（DSBs), 2)细胞自身调控的程序 性DSBs, 3)逆转录病毒转染细胞过程中产生的DSBs。而W上S种情况的细胞DNA损伤均可 诱导丫肥AX的磯酸化（C肥AX)和簇集形成焦点，该一过程可发生在几分钟之内，丫肥AX所 形成的焦点数量与造成的DNA双链断裂数量存在一一对应关系。因此，丫肥AX被认为是检 测细胞DNA双链断裂的特异性指标。
[0004] 目前，检测丫肥AX的方法主要包括；免疫巧光法，免疫印迹法，流式细胞技术间接 标记法。但该些技术存在操作步骤繁琐，易受非特异巧光干扰，多次洗漆细胞的丢失量大， 且试验周期长等问题。
【发明内容】
[000引本发明正是针对上述问题，提供一种基于丫肥AX的细胞DNA损伤检测方法。并将 其用于卷烟烟气中化合物的基因毒性检测。
[0006]本发明的目的是通过W下技术方案实现的： 一种基于丫肥AX的细胞DNA损伤检测方法，包括W下工艺步骤： 1) 配制实验试剂；（1)细胞培养液；（2)预冷的70%己醇；（3)磯酸缓冲盐溶液（PBS); (4)0. 5% 的TritonX-IOO; 2) 细胞培养；C册细胞生长于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，放置于37 °C、5% C〇2细胞培养箱中培养； 3) 细胞染毒：将指数生长期的Cffi)细胞(也适用于人肺癌上皮细胞A549细胞)，按 1XIO6个/孔的细胞密度接种于6孔板中，培养24h后，进行细胞染毒，每个处理组设=个 平行，染毒时间为24h; 4) 基于流式细胞仪对细胞中丫肥AX测定，具体步骤如下： a、 细胞提取：细胞染毒24h后弃去染毒液，加入500yLO. 25%膜酶，消化1-2min,弃 去膜酶，加入1HiL磯酸盐缓冲溶液（PBS)混悬，1500rpm/min离屯、，弃去上清，洗漆两次； b、 己醇固定；准备70%的己醇，-20°C预冷，在祸旋使细胞团粒松开后，边祸旋边一滴滴 的加入预冷的70%己醇1血，放置于-20°C冰箱固定过夜； c、TritonX-100破膜；取出固定的待检测样品，1500巧m/min离屯、，弃上清，用PBS洗漆 两次。加入 0.5% 的TritonX-IOO100Ul破膜； t加入FITC直标的Anti-肥AX(购至Biolegend公司）10JiL至待检测样品，室温解 育50min后转移到流式管中待检测； e、流式细胞仪检测：流式细胞仪参数设置；设置激发光；488nm;检测发射光通道：SYTOX巧光；FLlchannel(530/30band-passfilter);EMA巧光；FL3channel(670 long-passfilter)，每个批次试验须根据细胞状态调整巧光补偿和光电倍增参数，但批次 内保持其参数设置不变。
[0007] 5)结果与分析；通过流式细胞仪检测含有丫肥AX焦点的细胞数和细胞总数，并依 下述公式，计算检测的细胞中产生丫H2AX的焦点率；
[000引本发明中所用的实验试剂配制方法如下： (1) 细胞培养液；DMEM培养液+10%的胎牛血清（FBS) +100lU/mL青霉素+100yg/ mL链霉素； (2) 预冷的70%己醇；取无水己醇70血，用去离子水定容至100血，混匀后放置于-20 °C冰箱中预冷24h; (3) 磯酸缓冲盐溶液（PBS);0.2gK化，0. 2gKH2P04,8g化化，2. 9g化2册04* 12&0,加 双蒸水至1L，PH7. 2~7. 4,高压灭菌； (4) 0. 5% 的TritonX-IOO;取 0. 5 血TritonX-100,加入 99. 5 血的PBS，37°C水浴震 荡至溶解。
[0009] 所述染毒毒素可为卷烟烟气中的烟草特有亚硝胺NNK、杂环胺AaC。
[0010] 本发明所用溶液中除已明确标明的W外所设及的％均为体积百分比。与现有技术 相比，本发明方法具有如下优良效果： 在整个试验过程中减少了多次洗漆细胞的试验步骤，使操作方法更简便；针对间接 标记法中较强的非特异巧光干扰的问题，确立了流式直接免疫巧光标记的方法，减少了细 胞的丢失，检测过程更快速方便，检测结果也更稳定；本发明省去了间接标记法中标记第 一抗体和第二抗体的步骤，缩短了检测周期，提高了检测效率；本发明用流式细胞仪分析 丫H2AX的相对巧光强度，结果更客观、准确，统计学精度高。
【附图说明】
[0011] 图1为本发明的工艺步骤图。
【具体实施方式】
[001引实例1对NNK进行评价 收集处于指数生长期的Cffi)细胞W1X106个/孔细胞接种于6孔板中，于细胞培养箱 中培养2化后进行NNK染毒，染毒时间为24h。实验中WNNK的剂量分别为0yg/mL，25 yg/mL，50yg/mL，100yg/mL，200yg/mL和 400yg/mL染毒C册细胞，每种条件设 3 个 平行孔，置于37 °C、5%C02的细胞培养箱中培养24h。细胞染毒结束后，加入500uLO. 25% 膜酶，消化1-2min,弃去膜酶，加入1血磯酸盐缓冲溶液（PBS)混悬，1500巧m/min离屯、， 弃去上清，洗漆两次。己醇固定；准备70%的己醇，-20 °C预冷。在祸旋使细胞团粒松开后， 边祸旋边一滴滴的加入预冷的70%己醇ImU放置于-20 °C冰箱固定24h。TritonX-IOO破膜；取出固定的待检测样品，1500rpm/min离屯、，弃上清，用PBS洗漆两次。加入0. 5%的 TritonX-IOO100UL破膜。加入FITC直标的Anti-肥AX(购至Biolegend公司）10UL至待 检测样品，室温解育50min后转移到流式管中待检测。流式细胞仪检测；流式细胞仪参数 设置；设置激发光；488nm;检测发射光通道；SYTOX巧光；FLlChanneK530/30band-pass filter);EMA巧光；FL3channel(670long-passfilter),每个批次试验须根据细胞状 态调整巧光补偿和光电倍增参数，但批次内保持其参数设置不变。通过流式细胞仪检测含 有丫H2AX焦点的细胞数和细胞总数，并依下述公式，计算检测的细胞中产生丫H2AX的焦点 率。
[001引表1显示的是NNK染毒Cffi)细胞后丫肥AX的焦点数（平均值和标准差）。
[0014]实例2对AaC进行评价 收集处于指数生长期的Cffi)细胞W1X1〇6个/孔细胞接种于6孔板中，于细胞培养 箱中培养24h后进行AaC染毒，染毒时间为24h。实验中WAaC的剂量分别为0yg/ 血，2. 5yg/血，5yg/血，10yg/血，20yg/血和40yg/mL染毒C册细胞，每种条件 设3个平行孔，置于37 °C、5%C02的细胞培养箱中培养24h。细胞染毒结束后，加入500 yLO. 25%膜酶，消化1-2min,弃去膜酶，加入1血磯酸盐缓冲溶液（PBS)混悬，1500巧m/ min离屯、，弃去上清，洗漆两次。己醇固定；准备70%的己醇，-20 °C预冷。在祸旋使细胞 团粒松开后，边祸旋边一滴滴的加入预冷的70%己醇1mU放置于-20 °C冰箱固定过夜。 TritonX-IOO破膜；取出固定的待检测样品，1500巧m/min离屯、，弃上清，用PBS洗漆两次。 加入 0.5% 的TritonX-IOO100Ul破膜。加入FITC直标的Anti-肥AX(购至Biolegend 公司）10UL至待检测样品，室温解育50min后转移到流式管中待检测。流式细胞仪检 巧U;流式细胞仪参数设置：设置激发光；488nm;检测发射光通道；SYTOX巧光；FLlchannel (530/30band-passfilter);EMA巧光；FL3channel(670long-passfilter),每个批次 试验须根据细胞状态调整巧光补偿和光电倍增参数，但批次内保持其参数设置不变。通过 流式细胞仪检测含有丫H2AX焦点的细胞数和细胞总数，并依下述公式，计算检测的细胞中 产生丫肥AX的焦点率。
[00巧]表2显示的是AaC染毒Cffi)细胞后丫肥AX的焦点数（平均值和标准差）。
[001引表1NNK染毒CHO细胞后丫肥AX的焦点数
【主权项】
1. 一种基于YH2AX的细胞DNA损伤检测方法，其特征在于：包括以下工艺步骤： 1) 配制实验试剂：（1)细胞培养液；（2)预冷的70%乙醇；（3)磷酸缓冲盐溶液（PBS); (4) 0? 5% 的TritonX-IOO; 2) 细胞培养：CHO细胞生长于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，放置于37 °C、5% CO2细胞培养箱中培养； 3) 细胞染毒：将指数生长期的CHO细胞，按IXIO6个/孔的细胞密度接种于6孔板中， 培养24h后，进行细胞染毒，每个处理组设三个平行，染毒时间为24h; 4) 基于流式细胞仪对细胞中YH2AX测定，具体步骤如下： a、 细胞提取：细胞染毒24h后弃去染毒液，加入500yL0. 25%胰酶，消化1-2min，弃 去胰酶，加入ImL磷酸盐缓冲溶液（PBS)混悬，1500rpm/min离心，弃去上清，洗绦两次； b、 乙醇固定：准备70%的乙醇，-20°C预冷，在涡旋使细胞团粒松开后，边涡旋边一滴滴 的加入预冷的70%乙醇ImL，放置于-20°C冰箱固定过夜； c、TritonX-100破膜：取出固定的待检测样品，1500rpm/min离心，弃上清，用PBS洗绦 两次，加入 〇? 5% 的TritonX-IOO100yL破膜； d、 加入FITC直标的Anti-H2AX10yL至待检测样品，室温孵育50min后转移到流式 管中待检测； e、 流式细胞仪检测； 5) 结果与分析：通过流式细胞仪检测含有YH2AX焦点的细胞数和细胞总数，并依下述 公式，计算检测的细胞中产生YH2AX的焦点率：2. 根据权利要求1所述的基于YH2AX的细胞DNA损伤检测方法，其特征在于：实验试 剂的配制方法如下： (1) 细胞培养液：DMEM培养液+10%的胎牛血清（FBS) +100IU/mL青霉素+100yg/ mL链霉素； (2) 预冷的70%乙醇：取无水乙醇70mL，用去离子水定容至100mL，混匀后放置于-20 °C冰箱中预冷24h; (3) 磷酸缓冲盐溶液（PBS):0.2gKCL，0.2gKH2P04,8gNaCL，2.9gNa2HPO4* 12H20,加 双蒸水至1L，PH7. 2~7. 4,高压灭菌； (4) 0.5%的！'1'行〇1^-100:取0.5 1^1'1'行〇1^-100，加入99.5 1111的？85,371：水浴震 荡至溶解。3. 根据权利要求1所述的基于YH2AX的细胞DNA损伤检测方法，其特征在于：所述染 毒毒素为卷烟烟气中的烟草特有亚硝胺NNK、杂环胺AaC。4. 根据权利要求1所述的基于YH2AX的细胞DNA损伤检测方法，其特征在于：流式 细胞仪参数设置：设置激发光：488nm;检测发射光通道：SYTOX荧光：FLlchannel:530/30 band-passfilter;EMA焚光：FL3channel: 670long-passfilter。
【专利摘要】一种基于γH2AX的细胞DNA损伤检测方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：1）配制实验试剂，2）细胞培养，3）细胞染毒，4）基于流式细胞仪对细胞中γH2AX测定，5）结果与分析。本发明相比现有技术具有以下特点：在整个试验过程中减少了多次洗涤细胞的试验步骤，使操作方法更简便；针对间接标记法中较强的非特异荧光干扰的问题，确立了直接免疫荧光标记的方法，使检测过程更快速方便，检测结果也更稳定；本发明省去了间接标记法中标记第一抗体和第二抗体的步骤，缩短了检测周期，提高了检测效率；本发明用流式细胞仪检测γH2AX的相对荧光强度，结果更客观、准确，统计学精度高。
【IPC分类】G01N33/58, G01N15/14
【公开号】CN104964910
【申请号】CN201510451238
【发明人】赵俊伟, 李翔, 谢复炜, 康彧, 赵阁, 尚平平, 刘惠民, 谢剑平
【申请人】中国烟草总公司郑州烟草研究院
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年7月29日