取范围（4-18% )对啮齿动物中循环IGF-1、癌症发病率和肿瘤进展水平 的作用。18周龄雄性C57BL/6小鼠持续进食实验性、等卡路里的膳食39天，设计为提供高 (18%))或低（7%)源自蛋白质的卡路里量，而不强化CR或造成营养不良（图9A、B)。
[0110] 为了理解不同水平的蛋白质和IGF-1水平可如何影响新形成的肿瘤在他们各 自膳食一周之后存活和生长的能力，两个组都皮下移植20, 000同基因的、鼠黑素瘤细胞 (B16)。在移植后15天开始肿瘤测量，在他们各自膳食22天，在该点发现发病率在高蛋白 质水平组中是100%，但是在低蛋白质水平组中仅仅80% (图6A)。在第25天，发病率在 低蛋白质组中上升至90%，并且保持直到实验结束（图6A)。从第22天直到实验结束，月中 瘤尺寸在消耗更低量蛋白质的组中显著更小，指示更缓慢的肿瘤进展。在第39天，观察到 平均肿瘤尺寸在高蛋白质组中大78% (第36天P = 0. 0001 ;第39天P〈0. 0001)(图6B)。 在第16天获得和分析血液样品，以确定蛋白质摄取对IGF-1和IGF-1抑制蛋白，IGFBP-1的 作用。在低蛋白质（4%)组中，相比进食高蛋白质（18%)膳食的动物，血清IGF-1低35% (P = 0. 0004)(图6C)。相反地，相比高蛋白质组，在低蛋白质组中，血清IGFBP-1高136% (P = 0? 003)(图 6D)。
[0111] 为了进一步测试GHR-IGF-1轴促进癌症进展的假设，我们将皮下黑素瘤（B16)移 植至GHR/IGF-1缺乏GHRK0小鼠和它们各自的年龄-和性别-匹配的同窝仔畜对照（18周 龄雄性C57BL/6小鼠）。在移植后10天开始肿瘤测量并且继续直到第18天。数据显示当 与对照组中的进展相比时，GHRK0小鼠中的肿瘤进展明显被抑制（图6E ;P〈0. 01)。
[0112] 我们也使用乳腺癌小鼠模型，以测试蛋白质水平、肿瘤发病率和进展之间的关系。 12周龄雌性BALB/c小鼠放置在如为C57BL/6小鼠描述相同的膳食方案下，不同之处是小鼠 在第一周内，必须从4%转向7% kcal来自蛋白质膳食，以便防止体重减轻（图9E、F)。进 食这些膳食一周之后，小鼠被皮下移植20, 000同基因的、转移鼠乳腺癌的细胞（4T1)，并且 15天后评估肿瘤。在移植后18天（膳食的第25天），高蛋白质组中肿瘤发病率是100%， 但是在低蛋白质组中仅仅70 %。低蛋白质组中发病率在第39天升高至80 %，其保持直到 实验结束（图6F)。肿瘤进展数据也显示更低蛋白质膳食组具有更小的平均肿瘤尺寸。在 实验结束的第53天，相比高蛋白质组在低蛋白质组中观察到45%更小的平均肿瘤尺寸（P =0. 0038)(图6G)。如对于C57BL/6小鼠，在膳食蛋白质限制的第16天测量IGF-1。相比 高水平组，在低蛋白质摄取组中IGF-1水平下降30% (P〈0.0001)(图6H)。另外，低蛋白 质摄取也造成IGFBP1增加84% (P = 0. 001)(图61)，与C57BL/6遗传背景中观察的类似 (图6D)。类似地，当大豆蛋白质摄取从高水平下降至低水平时，我们观察到IGF-1下降30% (p〈0. 0001)(图6J)和IGFBP-1增加140% (p〈0. 0001)(图6K)。尽管用植物蛋白质替换相 同水平的动物蛋白对IGF-I和IGFBP1显示有效的趋势，差异不显著。这些数据提示更低的 蛋白质摄取可对降低癌症发病率和/或进展起作用，部分通过降低IGF-1和增加IGF-1抑 制剂IGFBP1。另外对各种类型的动物和植物基蛋白的研究是必要的，以确定它们对IGF-I 和IGFBP1的影响。
[0113] 细胞研究
[0114] 为了理解氨基酸水平和寿命之间是否存在基础关联，通过生存和突变率试验评估 具体浓度的氨基酸的存在对酵母生长和发展的影响。野生型DBY746酿酒酵母菌株在存在 一半（0.5X)、标准（IX)和双倍（2X)氨基酸浓度的情况下生长，所有的其他营养素保持不 变。在第1、3、5和8天测量生存。在第1和3天期间，没有观察到生存差异。在第5天， 2个最高氨基酸浓度显示增加的死亡率的趋势，其在第8天导致10倍降低生存的细胞（图 6L) 〇
[0115] 为了评估氨基酸、衰老和年龄_依赖性DNA损伤之间的关系，我们使用衰老酿酒酵 母测量自发突变率。相比暴露于〇. 5X氨基酸浓度的细胞，分别暴露于IX和2X氨基酸水平 在5天衰老细胞但不是年轻细胞中突变率是3和4倍高（图6M)。这些结果指示即使在单 细胞生物体中，氨基酸促进细胞衰老和年龄依赖性基因组不稳定。
[0116] 为了进一步分辨参与促进年龄-依赖性基因组不稳定的途径，我们测量了在存在 或没有氨基酸的情况下，通过Ras-PKA-Msn2-4Tor-Sch9-Gisi途径调节的压力应答基因的 诱导。对于在仅仅包含Trp、Le U和His的对照培养基中的细胞生长（对于在该菌株中生长 是必须的），培养基中所有氨基酸的存在降低了压力抗性基因的诱导，指示添加氨基酸足够 抑制细胞保护（图6N)。
[0117] Tor-Sch9途径延长寿命但是也促进DNA突变。为了确定Ras-cAMP-PKA信号传导 是否也调节年龄-依赖性基因组不稳定，我们研究了 ras2缺陷突变体。我们确认ras2 A 突变体是长命的（图11A)但是也显示Ras信号传导的失活减弱了年龄-和氧化应激-依 赖性基因组不稳定（图11B、11C、60、11D)。
[0118] 这些结果一起提示氨基酸能够至少部分通过激活Tor-Sch9和Ras/PKA途径和降 低压力抗性，影响突变频率和因此基因组不稳定的机制（图6P)。
[0119] 年老小鼠中低蛋白质摄取和体重保持
[0120] 基于观察的在50-65岁年龄受试者对65和更年长那些的受试者中低蛋白质膳食 相反作用，和65岁之后对BMI和IGF-1水平的明显下降，我们假设低蛋白质膳食的更年长 的受试者可能营养不良并且不能吸收或处理足够水平的氨基酸。为了测试小鼠中的这种可 能性，我们用包含18%或4%动物蛋白的等卡路里膳食饲养幼年小鼠（18周龄）和年老小 鼠（24月龄）。故意选择非常低蛋白质膳食，以揭示年老生物体中对蛋白质限制的任何灵 敏度。而保持高蛋白质膳食30的年老小鼠增重，低蛋白质膳食的年老而不是年幼小鼠至第 15天丢失它们体重的10% (图4A、B)，与衰老将蛋白质限制对死亡率的有益作用转化成不 利作用的影响一致。
[0121] 讨论
[0122] 这里，使用美国群体营养的主要全国代表性研究，我们的结果显示在45岁和以上 的那些中，蛋白质摄取水平与增加的糖尿病死亡率的风险相关，但是与全因、癌症或CVD死 亡率不相关。然而，我们发现了在蛋白质消耗和死亡率之间的年龄相互作用，50-65岁年 龄的受试者经历来自低蛋白质摄取的益处和66+年龄的受试者经历来自低蛋白质膳食的 坏处一一至少对于总体死亡率和癌症。这可解释为什么先前未描述本文报道的蛋白质摄 取、IGF-1和死亡率之间的强相关性。此外，在测量IGF-1水平的2253名受试者中，高蛋白 质摄取的那些的全因和癌症死亡率的风险相比低蛋白质摄取组增加，甚至对也具有高水平 IGF-1的那些进一步增加。这与之前将IGF-1水平与各种类型的癌症相关联的研究一致。
[0123] 注意，有证据表明消耗的蛋白质的类型可能是重要的。我们的结果显示源自动物 来源的蛋白质比例负责相当比例的总体蛋白质摄取和全因和癌症死亡率之间的相关性。这 些结果与对红肉消耗和由于全因、CVD和癌症的死亡之间的相关性的最近发现一致。美国之 前的研究已经发现低碳水化合物膳食与总体死亡率的增加相关并且当这样的膳食伴随增 加的动物基产品的消耗时，总体上的风险，以及CVD和癌症死亡率甚至进一步增加。但是， 我们的研究指示动物蛋白对IGF-I、衰老、糖尿病和癌症的作用在确定蛋白质摄取的18年 随访调查中可能主要促进45-65岁人们的死亡率。到那时，在调查时65的群组将会是83 岁年龄，强调高蛋白质摄取可促进比65更大的受试者的死亡率。
[0124] 来自酵母和小鼠的我们的结果通过提供氨基酸、压力抗性、DNA损伤和癌症发病 率/进展之间的关系也可解释蛋白质、癌症和总体死亡率之间的至少部分主要的关联。在 小鼠中，降低的蛋白质水平造成的改变具有足够有效防止10-30%的肿瘤的发生，甚至当 20, 000肿瘤细胞已经存在于皮下位点时。此外，黑素瘤和乳腺癌二者的进展被低蛋白质膳 食强烈抑制，指示低蛋白质膳食可应用于癌症预防和治疗二者。
[0125] 尽管蛋白质摄取与在基线是中年的成年人增加的死亡率相关，也有证据表明低蛋 白质膳食可能对于更年长的成年人是危险的。在老年人中高和中蛋白质摄取与相比低组的 主要改善相关，提示表示至少消耗的10%的卡路里的蛋白质摄取可能在65岁或可能75岁 之后是必要的，以降低年龄-依赖性的体重减轻，并且可能防止IGF-1和其他重要的因子的 过度丢失。之前的研究已经注意了增加的蛋白质摄取和所得IGF-1的增加可证明在更年长 的成年人中有益。事实上，低蛋白质膳食从保护作用至有害作用的突然转变与已知体重稳 定并且然后下降的时间点巧合。基于之前的纵向的研究，体重趋于增加直到50-60岁，在该 点稳定然后对于超过65岁的那些以平均0. 5%每年开始稳定下降。我们推测这可取决于 受试者的体重减轻和虚弱，所述受试者认为是已经丢失了他们体重大部分百分数并且具有 低BMI的虚弱的受试者更容易遭受蛋白质营养不良。也可能的是其他因素，比如炎症或遗 传因素可能造成年长受试者对蛋白质限制的敏感，与我们的小鼠研究一致。
[0126] 尽管其他研究已经注意啮齿动物中营养素吸收与年龄相关的下降，其与pH微气 候的改变、受损的衰老内脏中适应性应答，和肠道形态的改变相关，但是仍不清楚形态学和 衰老的适应性改变之间的相关性。在人中，一些研究已经显示膳食蛋白质消化和吸收动力 学在健康的、年长男性中体内不受损，但是，这些研究也报道了增加的AA内脏提取可能导 致对外周组织的下降的可用性，并且推测在低蛋白质摄取或增加的蛋白质要求的情况下， 限制的全身性膳食AA的可用性可能造成下降的肌肉蛋白合成。此外，在人中其他因素，比 如差的牙齿、药物和心理问题也对营养不良的速度起重要的作用。
[0127] 之前也已经显示IGF-1在更年长年龄中下降，增加虚弱的风险和死亡率。因此我 们的发现可解释与IGF-I和死亡率相关的争论，表明最低水平的蛋白质和可能的IGF-1在 老人中是重要的或表明低循环IGF-1反映营养不良虚弱的状态和/或发病。事实上，已知 炎症和其他不适降低IGF-1水平，增加了低蛋白质和低IGF-1组可包含大量的具有或处在 发展主要疾病的状态下的营养不良和虚弱个体的可能性。
[0128]应认识到我们的研究有一些局限性。首先，如果24小时时间不是通常的天，单个 24-小时膳食记忆的使用，随后多达18年死亡率评估可能使膳食实践错误分类。但是，93% 的我们的样本报告24小时时间代表正常的天。我们也包括该变量作为我们分析的对照。此 外，24-小时膳食记忆已经显示是鉴定受试者的"正常膳食"的非常有效的方法。尽管我们 必须承认对膳食消耗的纵向数据的缺乏是我们研究的潜在局限性，六年中老年人的膳食一 致性的研究揭示了膳食习惯随着时间的推移的稍微改变。在二十年中观察膳食习惯的另一 研究显示尽管随着人变老，对于蛋白质、脂肪和碳水化合物的能量摄取下降，但是遍及该三 个类型，下降是相同的。
[0129] 我们的研究的另一局限性是受访者分类成蛋白质组，并且然后对样本分类用于 分析，产生相对小的样本数量，尤其对于涉及在基线没有糖尿病的糖尿病死亡率的分析或 KF-i子样本的参与者的分析。结果，我们的风险比和 95%置信区间可明显大于用更大的 样本数量所会见到的。然而，人们预期小的样本数量降低了我们的功效并且使得难以检测 相关性。所以，我们检测显著性的能力指示蛋白质和死亡率之间的相关性是健壮的。此外， 来自我们死亡率分析的95%置信区间的下限也大于1.0,表示增加的风险可能大。最后，考 虑这些局限性，我们的研究通过其可靠的具体原因死亡率数据的使用，以及其包括大的全 国代表性样品一一之前的文献通常丢失的特征而被加强。
[0130]总体上，我们的人和动物研究显示中年期间的低蛋白质膳食可用于预防癌症和总 体死亡率，其通过可至少部分参与调节循环IGF-1和可能的胰岛素水平的过程。与其他流 行病学和动物研究一致，我们的发现提示其中植物基营养素占食物摄取大部分的膳食可能 使健康益处最大化。但是，我们建议至多65岁和可能75岁，这取决于健康状态，医药协会食 物和营养局公开的〇. 7至〇. 8克的蛋白质/kg体重/天，目前视为最低要求，相对于19-70 岁成年人消耗的1-1. 3g克的蛋白质/kg体重/天可能是保护性的。我们也建议在更大的年 龄下，可能重要的是避免低蛋白质摄取和逐渐采用中至高蛋白质可能大部分植物基消耗， 以使得保持健康的体重和避免虚弱。
[0131] 实验程序
[0132]用于人数据的营养素摄取
[0133]营养素摄取数据是基于24-小时期间食物和饮品摄取的报告。经基于自动、微机 编码系统收集数据，关于总体八十种营养素的信息。使用该方法收集膳食数据，有数个优 势。假定消耗和记忆之间过去的时间短，参与者通常能够记忆更多的信息。而且，不像报告 方法，24-小时膳食记忆依赖于消耗后的数据收集，降低了评估以改变膳食习惯的可能。此 外，24-小时记忆已经显示相比常用的食物频率问卷是总能量和蛋白质消耗的更强评估，并 且也已经显示比区块食物-频率问卷和国家癌症协会的膳食历史问卷二者是总能量和营 养素摄取的更有效测量。最后，也已经发现该方法精确评估能量、蛋白质、脂肪和碳水化合 物摄取，不必考虑体重指数。
[0134]流行病学死亡率随访
[0135]死亡率数据可获得自国家死亡指数。对于113种潜在的根本死亡原因的信息 (UC0D-113)用于确定全因死亡率、心血管（CVD)死亡率、癌症死亡率和糖尿病死亡率。
[0136]用于人数据的统计分析
[0137] Cox比例风险模型用于评估来自蛋白质的卡路里摄取对随后全因、CVD、癌症和糖 尿病死亡率之间的相关性一一后面三个使用竞争风险结构进行。接下来，我们测试年龄和 蛋白质消耗对死亡率的相关性之间的相互作用。基于这些结果，我们将受试者分成两个年 龄组（50-65岁和66+岁），其用于剩余的分析。年龄分层的比例风险模型用于评估两个年 龄组中来自蛋白质的卡路里百分数与死亡率的相关性，并且检查关系是否受到来自脂肪的 卡路里百分数、来自碳水化合物或动物蛋白的卡路里百分数的影响。对于IGF-1子样本，重 新评估风险模型，以确定是否包括IGF-1改变蛋白质摄取和死亡率之间的相关性。最后，比 例风险模型用于检查蛋白质和IGF-1之间的相互作用，并且用于计算每个蛋白质组在各个 IGF-1水平的预测的风险比，以确定是否蛋白质摄取基于IGF-1水平不同地影响死亡率。使 用样本权重、考虑采样设计和控制年龄、民族/种族、教育、性别、疾病状态、抽烟、膳食改变 和总卡路里消耗进行所有的分析。
[0138] 用于酵母和小鼠实验的材料和方法
[0139] 使用Cox比例风险模型我们发现蛋白质消耗和全因、CVD或癌症死亡率之间没有 相关性（表14)。但是，高和中蛋白质消耗可能与糖尿病相关的死亡率相关。一种解释是糖 尿病可能在这些组中更流行，可能因为在糖尿病诊断之后转向更高的蛋白质、更低的脂肪 和更低的碳水化合物摄取。
[0140] 最后，发现高和低蛋白质消耗与66岁和更年长受试者的糖尿病死亡率风险增加 超过十倍相关。但是，高蛋白质组中的具有糖尿病历史的更高患病率的受试者和低蛋白质 组中少量的死于糖尿病受试者可能造成了这一结果，因此强调需要另外的研究，以确定蛋 白质摄取对糖尿病发病率和死亡率的作用（HR : 10. 64 ;95% Cl :1. 85-61. 31)。
[0141] 补充的材料和方法
[0142] 人数据中的IGF-I
[0143] 随机选择NHANES III中一半的受试者，在推荐的九小时禁食后，参与早上检查。该 子样本中，包括在我们的研究中的2, 253名受试者同意并已经测量IGF-I的禁食血清数据。 通过Diagnostic System Laboratories Inc.，使用标准实验室方案测量IGF-I并且以ng/ ml计报告。
[0144] 人数据的潜在混杂者
[0145] 年龄、民族/种族、教育、性别、疾病状态、抽烟、膳食改变和总卡路里消耗包括在 分析中作为潜在的混杂者。年龄以岁报告并且通过NHANES在数据集中上限是90,以避免受 访者的保密。产生虚变量，以将受试者分成三个民族/种族类别：非西班牙白人、非西班牙 黑人和西班牙人，教育通过上学的年数表示。为自报告的抽烟状态产生虚变量一一从不、之 前和现在。也要求受试者报告他们的疾病历史，以疑问短语，如"医生是否曾告诉你患……" 并且用于产生三个癌症、心肌梗死和糖尿病历史存在的虚变量。使用对三个问题的回答评 估最近的膳食摄取改变一一1) "在过去的12个月期间，你是否尝试减肥？ ";2) "在过去的 12个月期间，你因为任何医学原因或健康条件而改变了你的饮食？ ";和3) (24-小时膳食记 忆之后）"比较昨天消耗的食物与正常的"。从身体右侧开始在髂嵴测量相比BMI优选作为 肥胖指示的腰围至最接近0. lcm。
[0146] 小鼠中的癌症模型
[0147] 根据USC的动物护理和使用委员会协会程序进行所有的动物实验。为了建立皮 下癌症小鼠模型，我们用B16黑素瘤细胞注射18周龄，雄性C57BL/6小鼠以及10月龄 GHRKO小鼠，年龄一致的同窝仔畜对照小鼠，和野生型同窝仔畜，以及用4T1乳腺癌细胞注 射12周龄雌性BALB/c。在注射之前，收获在对数生长期的细胞并且悬浮在无血清高葡萄 糖Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM)，以2x 105细胞或2x10 6,并且随后在下背皮下注 射100ul (2x 104细胞每只C57BL/6或BALB/c小鼠；2x