丙烯酰胺储液配方
[0052]
[0053] 表中AB-3表示交联度为3%的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺储液。
[0054] 表2电极缓冲液及凝胶缓冲液的配方
[0055]
[0056] 表中Tris表示三轻甲基氨基甲烧，Tricine表示三轻甲基甘氨酸，HC1表示盐酸 (密度1. 20g/mL，质量分数36%，12mol/L)，SDS表示十二烷基磺酸钠。
[0057] 利用表3中配方分别配制4%的浓缩胶和10%的分离胶，添加好相关固体药品之 后静置24h再用盐酸调整pH，不同浓度的盐酸体积可能不同，能将pH调整至所需范围内均 可，其中凝胶缓冲液过滤后方可使用。其中，凝胶缓冲液的配方见表2。采用迷你胶操作系 统，在玻璃板组成的灌胶模块中，首先灌注6mL分离胶，液封（采用水）后放置1小时，其次 灌注4mL浓缩胶，放置40分钟，使其充分凝结，形成上层为浓缩胶下层为分离胶的聚丙烯酰 胺凝胶。
[0058] 表 3Tricine-SDS-PAGE中一板 10.lcm(W)X7. 3cm(L)不连续胶的配方
[0059]
[0060] 表中AB-3的配制见表1 ;凝胶缓冲液的配制见表2;APS表示过硫酸铵，其质量体 积浓度为0.lg/mL，现用现配；TEMED表示四甲基乙二胺。
[0061] 2)电泳
[0062] 将上述制备得到的聚丙烯酰胺凝胶（不连续胶），去掉支架，转移至电泳 槽（Bio-Rad，mini-PROTEANTetra电泳槽，货号：552BR089245)中，电源为PowerPac Basic(Bio-Rad，货号：041BR69536)。根据表2中的配方配制电极缓冲液，阴极缓冲液加到 电泳槽内侧，阳极缓冲液加到电泳槽外侧，使阴阳极电解液独立工作。
[0063] 将超低分子量蛋白质MarkerII(北京汇天东方科技有限公司，货号：HT412)95°C 预热5min后上样进行Tricine-SDS-PAGE电泳。按照表4设置电压，浓缩胶（4% )中为 60V，样品即在浓缩胶中不断迁移，待样品压成一条细线即将进入分离胶时，再将电压升高， 分离胶（10% )电压为100V，待溴酚蓝跑到分离胶底端时停止电泳。
[0064] 表4迷你胶Tricine-SDS-PAGE的电压选择
[0065]
[0066] 卸掉玻璃板，首先将分离胶置于蒸馏水中清洗，之后放置于固定液中固定0.5小 时，再之后用考马斯亮蓝染色1. 5小时，最后脱色1小时（每20分钟换一次脱色液）。固定 液、考马斯亮蓝染色液、脱色液的配制见表5。将洗脱后的凝胶包入保鲜袋，置于Umax扫描 仪中扫描拍照。
[0067] 表5考马斯亮蓝染色试剂
[0068]
[0070] 为对比试验结果，采用Glycine-SDS-PAGE进行电泳，首先按照表6所示配方，分别 制备浓缩胶和分离胶，浓缩胶和分离胶的交联度和浓度与上述Tricine-SDS-PAGE中的相 同（分离胶C= 3%，T= 10% ;浓缩胶C= 3%，T= 4% )。
[0071] 表 6Glycine-SDS-PAGE中一板 10. 1cm(W)X7. 3cm(L)不连续胶的配方
[0072]
[0073] 表中AB-3的配制见表1 ;Tris-HCl表示三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液；SDS 表示十二烷基磺酸钠，10%SDS由10gSDS溶于100mL水制得；APS表示过硫酸铵，10%APS 由0.lgAPS溶于lmL水制得；TEMED表示四甲基乙二胺。
[0074] 对超低分子量蛋白质MarkerII(北京汇天东方科技有限公司，货号：HT412)进行 电泳分离，电极缓冲液采用三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸缓冲体系，阴阳极电解液相同，配方 如下：
[0075] 10X蛋白电泳缓冲液：pH8. 3(25mmol/LTris，0. 25mol/L甘氨酸，0? 1%SDS):即 将30. 3gTris、188.0g甘氨酸和10gSDS用蒸馏水定溶至1L。使用时稀释10倍：100mL的 10X蛋白电泳缓冲液加水至1L。
[0076] 实验结果如图1中所示，左侧为现有技术中采用Glycine-SDS-PAGE，即电泳缓冲 液为三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸缓冲体系得到的胶图，右侧为Tricine-SDS-PAGE，即本发 明使用的三羟甲基氨基甲烷-三羟甲基甘氨酸缓冲体系进行电泳得到的胶图。由图可知， 在迷你胶操作系统中，以本发明聚丙烯酰胺凝胶进行Tricine-SDS-PAGE电泳对小分子蛋 白进行分离的效果优于现有技术。
[0077] 实施例2、小分子量蛋白的电泳
[0078] 按照表3中的配比分别配制4%的浓缩胶和18%的分离胶，灌注不连续胶。分别 将超低分子量蛋白质Marker11(北京汇天东方科技有限公司，货号：HT412) (95°C，5min变 性）和彩虹预染超低分子量蛋白质Marker(北京汇天东方科技有限公司，货号：RTD6110) (不需要变性）上样后进行电泳分离，按照表4设置电压，浓缩胶（4%)中60V，分离胶 (18% )中140V，其它操作与实施例1中的操作相同，实验结果如图2所示。
[0079] 实施例3、本发明聚丙烯酰胺凝胶与WesternBlot的兼容性测试
[0080] 裂解3T3-L1细胞样品（采购于美国模式培养物集存库，货号：CL-173)，提取蛋白 (总蛋白）经BCA定量后，将蛋白提取液f布释并以10yg(蛋白质总质量）和15iig(蛋白质 总质量）上样进行电泳分离。上样之前对蛋白进行变性处理，即将蛋白4X上样缓冲液（北 京汇天东方科技有限公司生产，货号：P1015)与所提取的蛋白样品混合，置于99°C，10min。 电泳后进行转膜、一抗杂交（持家基因P-Actin的一抗米购于Abmart公司，货号：P30002 ; 目的基因的一抗采购于圣克鲁斯生物技术公司，货号：sc-30223)、二抗杂交（二抗采购于 Abmart公司，货号：M21003)等操作，最后对PVDF膜显色、曝光（转膜、一抗杂交、二抗杂交 均无特异性，按常规的WesternBlot均可）。最终实验结果如图3所示，图片上部为持家基 因（P-Actin基因）表达的蛋白质，分子量42kDa;图片下部为目的基因表达的蛋白质，对 应分子量为14kDa。
[0081] 图3中，左侧三个条带上样量为10iig(总蛋白），右侧三个条带的上样量为 15iig(总蛋白），由此可知本发明中聚丙烯酰胺凝胶与WesternBlot的下游技术能良好兼 容。
【主权项】
1. 一种聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于：它包括独立配制的浓缩胶和分离胶； 每份所述浓缩胶的原料组成如下： 2. 67mL水、0. 33mL丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液、ImL凝胶缓冲液、30 ii L过硫酸铵 水溶液和3 ii L四甲基乙二胺； 每份所述分离胶的原料组成为如下1)或2): 1) 2. 20mL水、I. 2mL丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液、2mL凝胶缓冲液、0. 6mL丙三醇、 30 y L过硫酸铵水溶液和3 ii L四甲基乙二胺； 2) 0. 88mL水、2. 23mL丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液、2. 23mL凝胶缓冲液、0. 66mL丙 三醇、22 ii L过硫酸铵水溶液和2. 2 ii L四甲基乙二胺； 所述丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液为丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的混合水溶液； 所述凝胶缓冲液由三羟甲基氨基甲烷、十二烷基磺酸钠和盐酸溶于水后得到； 所述过硫酸铵水溶液的质量体积浓度为0. lg/mL。2. 根据权利要求1所述的聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于：每IOOmL所述丙烯酰胺-甲 叉双丙烯酰胺溶液的原料组成如下： 48g丙烯酰胺、I. 5g甲叉双丙烯酰胺和余量的水。3. 根据权利要求1或2所述的聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于：每300mL所述凝胶缓冲 液的原料组成如下： 36. 3g三羟甲基氨基甲烷、2mL质量百分含量为36 %~38 %的盐酸水溶液、0. 3g十二烷 基横酸纳和余量的水。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于：所述浓缩胶与所 述分离胶的体积比为2:3。5. -种电泳套装，包括权利要求1-4中任一项所述聚丙烯酰胺凝胶和三羟甲基氨基甲 烷-三羟甲基甘氨酸缓冲体系。6. 权利要求1-4中任一项所述聚丙烯酰胺凝胶和权利要求5所述的电泳套装在电泳分 离小分子蛋白或多肽中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：在电泳分离之前，将所述分离胶和所述浓 缩胶依次灌注至灌胶模块中。8. 根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述电泳分离时的电压设置如下： 当待分离样品流经所述浓缩胶时，电压为60V，时间为25~35分钟；当待分离样品流 经所述分离胶时，电压升高至100V或140V，时间为40~80min。
【专利摘要】本发明公开了一种聚丙烯酰胺凝胶及其在电泳分离小分子蛋白或多肽中的应用。该聚丙烯酰胺凝胶包括独立配制的浓缩胶和分离胶；每份所述浓缩胶原料组成如下：2.67mL水、0.33mL丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液、1mL凝胶缓冲液、30μL过硫酸铵水溶液和3μL四甲基乙二胺；每份所述分离胶原料组成为如下1)或2)：1)2.20mL水、1.2mL丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液、2mL凝胶缓冲液、0.6mL丙三醇、30μL过硫酸铵水溶液和3μL四甲基乙二胺；2)0.88mL水、2.23mL丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液、2.23mL凝胶缓冲液、0.66mL丙三醇、22μL过硫酸铵水溶液和2.2μL四甲基乙二胺。所用电极缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-三羟甲基甘氨酸缓冲体系。本发明易于推广、操作简单、分辨率高、与免疫印迹等兼容性好。
【IPC分类】G01N33/68
【公开号】CN105021820
【申请号】CN201410654196
【发明人】赵春江, 姜顺严, 张博, 吴常信
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2014年11月17日