荧光纳米磁性粒子-多肽底物复合体及其制备方法
【专利说明】
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，特别涉及一种荧光纳米磁性粒子-多肽底物复合体及其制备方法。
【【背景技术】】
[0002]肿瘤一直以来都是广大临床工作者和科研人员努力钻研和攻克的目标之一，目前对于大部分肿瘤治疗来说，只有做到早期诊断，才可以做到肿瘤的有效治疗。肿瘤的早期诊断依赖于特异性的生物标记物。良好的生物标记物筛查方法，应当是创伤小而重复性好，最为理想的是通过简单的血样或尿样检测即可检测出肿瘤组织特异分子。此外，筛选技术应该足够灵敏，既可检测出早期癌症，又可准确地将未患癌症者进行区分。已鉴定的癌症生物标记物中，证明确实具有临床意义的如前列腺特异性抗原(PSA)、癌胚抗原(CA125)和甲状腺球蛋白，特异性仍需进一步证实，需要结合其他诊断工具才能预测疾病发生、复发、对病情进行分级和监测治疗效果。而那些在血浆或血清中的浓度为纳摩尔级别的蛋白质，需要专门的放免实验才能检出并定量。因此发现新的、更好的肿瘤生物标记，开发出简单易行的检测方法势在必行。
[0003]血清蛋白酶是新近发现的一种肿瘤标志物，他们在一些癌前病变、甚至是在肿瘤的高危人群血清中就发生了活力的改变，因此针对这些酶类活力改变设计的肿瘤早期诊断方法具有重大意义。已经报道的在正常人群和肿瘤人群血清中存在表达差异的蛋白酶有:半胱氨酸蛋白酶3、半胱氨酸蛋白酶2、基质金属蛋白酶9、纤溶酶和血清组织蛋白酶S。针对蛋白酶在正常和癌症患者血清中活力改变的特点，结合纳米技术，利用荧光分子作为显示分子，可以设计新型、灵敏的方法用在癌症的早期筛查，为癌症的早期治疗提供依据和保障，尽可能地减轻患者的痛苦和经济负担，提高患者的生活质量，延长其寿命。
【
【发明内容】
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[0004]本发明的首要目的在于提供一种荧光纳米磁性粒子-多肽底物复合体。
[0005]本发明的另一目的在于提供所述荧光纳米磁性粒子-多肽底物复合体的制备方法。
[0006]本发明的目的通过以下技术方案实现:一种荧光纳米磁性粒子-多肽底物复合体，包括纳米磁性粒子、荧光分子以及链接在所述纳米磁性粒子和荧光分子之间的蛋白酶多肽底物。
[0007]所述蛋白酶多肽底物可被血清中的蛋白酶酶解。
[0008]所述多肽底物为ROX-SGGGDEVDGGGSK。
[0009]所述纳米磁性粒子为Fe3O4纳米磁性粒子。
[0010]所述荧光分子的发射波长大于600纳米。
[0011]所述荧光分子为Cy5、Cy5.5或R0X。
[0012]所述荧光纳米磁性粒子-多肽底物复合体的制备方法，包括如下步骤:取纳米磁性粒子，经m)C(碳化二亚胺)和NHS (N-羧基硫代琥珀亚胺)活化处理后，按每毫克纳米磁性粒子加入1.546-3.092 μ g荧光蛋白酶多肽底物混合后加入MES (脂肪酸甲酯磺酸盐)中，混合均匀后，得到荧光纳米磁性粒子-多肽底物复合体；所述纳米磁性粒子、EDC和NHS的摩尔比为1:1.2:1.2。
[0013]所述纳米磁性粒子优选采用以下方法合成:将乙酰丙酮合铁、二苯醚和油胺混合均匀，氮气保护下升温至100-120°C后保温l_2h，再升温至275-295°C，回流l_2h后冷却至室温，得到黑色沉淀；将黑色沉淀进行除杂处理后加入环己烷，超声处理后取上清液，为Fe3O4纳米磁性粒子的环己烷溶液；每毫升二苯醚加入52.98-88.29mg乙酰丙酮合铁，所述二苯醚、油胺和环己烷的体积比为1:2: (0.5-1.5)；
[0014]所述除杂处理优选采用以下方法进行:将黑色沉淀进行磁分离后，用乙醇进行洗涤后再次进行磁分离，重复处理三次；
[0015]所述磁分离优选为磁铁吸附分离；
[0016]所述超声处理的时间优选为30_60min ；
[0017]所述Fe3O4纳米磁性粒子为6_15nm Fe3O4纳米磁性粒子,为水溶性壳聚糖超顺磁水溶性Fe3O4纳米粒子。
[0018]所述MES 优选为 pH6.0、25mM MES。
[0019]所述混合均匀优选为室温震荡30_60min ；
[0020]所述震荡优选为于1000-3000rpm旋转震荡。
[0021]所述荧光分子优选为在同一激发波长下、具有不同发射波长、且发射波长之间距离较远的荧光分子，并且受到激发后发出不同颜色。这样的选择有助于避免单个荧光分子之间的互相干扰，可以同时检测多种蛋白酶活力的变化。
[0022]所述荧光分子的发射波长优选大于600纳米。
[0023]所述荧光分子优选为Cy5、Cy5.5或ROX。
[0024]所述活化处理优选为在室温下进行超声处理；
[0025]所述超声处理优选于40KHZ进行超声处理。
[0026]所述蛋白酶多肽底物优选采用以下方法进行筛选:利用细菌展示技术结合流式细胞技术筛选在肿瘤患者和正常人群中差异表达蛋白酶的底物序列。确定不同底物多肽序列与蛋白酶之间的亲和力，选择亲和力最高的多肽-蛋白酶组合用于构建多肽纳米磁性粒子复合体。
[0027]针对caspase3蛋白酶的荧光蛋白酶多肽底物序列优选为ROX-SGGGDEVDGGGSK。
[0028]在复合体构建中，用于连接纳米粒子、多肽底物和荧光分子之间的肽链长度为5-10个氨基酸。
[0029]步骤⑵中，可以将得到的荧光纳米磁性粒子-多肽底物复合体重悬在100 μ L、ρΗ7.4的PBS中，并在荧光显微镜下观察偶联情况。
[0030]所述荧光纳米磁性粒子-多肽底物复合体为应用于肿瘤早期诊断的多肽底物复合体。肿瘤病人血清中存在一种或几种活力增强或者表达增加的蛋白酶；当受测样本或血液中存在活力增强或者表达增加的蛋白酶时，蛋白酶可以酶解与荧光分子相连的多肽，使得荧光分子从纳米磁性粒子上脱落下来，通过观察纳米磁性粒子上荧光信号强度，判断肿瘤是否存在。
[0031]本发明相对于现有技术具有如下的优点和有益效果:本发明结合纳米技术，集合了纳米磁性粒子的富集作用和荧光分子的显示作用，按每毫克纳米磁性粒子加入
1.546-3.092 μ g荧光蛋白酶多肽底物而构建荧光纳米磁性粒子-多肽底物多功能复合体，通过检测由于蛋白酶对多肽底物的酶解而导致的链接在纳米磁性粒子上的荧光信号的减低情况，对血清中与肿瘤相关的蛋白酶的活性进行评定，从而用于癌症的早期筛查，为癌症的早期治疗提供依据和保障，尽可能地减轻患者的痛苦和经济负担，提高患者的生活质量。
【【附图说明】】
[0032]图1是实施例1的纳米磁性粒子的扫描电镜图。
[0033]图2是实施例1的荧光纳米磁性粒子-多肽底物复合体的结构示意图。
[0034]图3是实施例1的荧光纳米磁性粒子-多肽底物复合体的荧光显微镜图；其中:A为荧光纳米磁性粒子-多肽底物复合体的荧光显微镜图为荧光纳米磁性粒子-多肽底物复合体未加caspase3在37°C水浴后的荧光显微镜图；C为荧光纳米磁性粒子-多肽