用于透化固定的血细胞的组合物及其用图
【专利说明】
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请作为PCT国际专利申请于2013年12月23日提交申请，并主张2012年12 月28日申请的61/747, 044号美国专利申请为优先权，此处通过引用方式包含其全部公开 内容。
技术领域
[0003] 本发明涉及一种用于透化固定的血细胞的细胞处理组合物、所述细胞处理组合物 的用途以及一种用于处理生物样品的方法，所述生物样品包含用于后续细胞内和/或细胞 外表位如磷酸表位分析的固定的白细胞。本发明进一步涉及一种含有所述细胞处理组合物 的试剂盒。
【背景技术】
[0004] 细胞（例如，血细胞）分析领域的最近的发展，已经能够提供有价值的工具用于对 细胞内和细胞表面的细胞结构进行详细分析。为了检测特定的细胞结构的存在，通常使用 多标记的结合剂例如对细胞外和/或细胞内确定的标记物具有特异性的单克隆抗体，对细 胞进行染色，以此来区分特定的目标细胞。例如，通常通过使用特异性细胞表面标记物来区 分不同亚类的白细胞，然而多种细胞内标记物，例如与细胞质或细胞核相关的结构，对于研 究所研究的细胞的功能特性变得更加重要。可以通过合适的设备，优选流式细胞仪，对通过 所述特异性结合剂标记的细胞进行分析，所述流式细胞仪能够检测并区分多种标记和其它 的细胞特性，如粒度和尺寸。
[0005] 然而，早期的流式细胞仪的应用主要涉及对细胞表面抗原的检测，其利用各自的 抗体是容易实现的，对细胞内靶表位的标记构成了更大的挑战，这是因为为了使细胞膜对 各自的结合剂是可渗透的，其需要对细胞进行特殊的预处理，所述结合剂对细胞内目标位 置具有特异性。由于必须使细胞膜对于大分子如荧光标记的抗体是充分可渗透的，因此这 种透化是关键步骤。同时，不同细胞群的细胞结构需要维持足够的保全，从而保持各自的特 征性光散射性能，并且胞质蛋白不流失到细胞外而是保存在自身细胞内。在透化步骤之前 或与透化步骤同时通常进行固定步骤以提供这种稳定性。当保全条件变得更严谨，即当使 用更强的蛋白变性工序时，这种结构上的保全变得更加困难。
[0006] 所需要的固定反应经常包含对侵蚀剂（aggressivereagent)，如甲醛的 利用，其可以破坏或至少降低通过各自的结合剂区分细胞亚型的表面抗原的可达性 (accessibility)。因此，一些早期方法包含利用各自的标记结合剂来标记细胞表面结构的 初始步骤。然后，细胞被固定、透化并被对细胞内靶标具有特异性的不同的结合剂处理。接 着这些被标记的细胞在，如流式细胞仪中被检测和分类。然而，在目前使用的透化工序中， 所需要的成分（甲醛、乙醇和清洁剂（detergent))彼此之间、以及与后续使用的作为结合 剂的抗体之间是不兼容的。因此，为了除去干扰试剂的残留物，细胞需要多个清洗步骤。然 而，这种处理的严格条件可能较容易地消除一些一些较敏感的细胞表面抗原的抗原反应活 性，所述细胞表面抗原经常用于识别各自的靶细胞群，如CD14。
[0007] 在细胞信号传导的情况中，蛋白质经常要经受可逆的磷酸化。这种动态的磷酸化 工序涉及竞争性的磷酸化和去磷酸化反应，在任何一个给定时刻磷酸化水平反映出催化这 些反应的蛋白激酶和磷酸酶在此时刻的相对活性。因此，磷酸-表位的分析可以对单个细 胞中的信号和代谢过程的调节给出有价值的实时的了解。因此，对于研究和诊断应用来说， 对多种信号传导酶如磷酸激酶，例如丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化状态的分析变得越来越 重要。例如，对这种磷酸化作用的研究的一个重要应用是对癌症和自身免疫疾病的治疗，其 中，特定磷酸-表位的磷酸化或去磷酸化可以指示给患者施用的或体外实验用的磷酸激酶 抑制药物的有效性。
[0008] 已经公认的是磷酸-表位难以露出（或"暴露"）于各自的结合剂。在一些情况 中，这些表位是线性表位，为了有效的抗体结合，所述线性表位可能需要对位于表位上的蛋 白质进行变性。磷酸化的Stat-5蛋白质的磷酸-表位是特别难以暴露的磷酸-表位的一 个例子。为了暴露这些表位，通常需要非常严格的变性条件。然而，一个显著的风险是在这 样激烈的处理下，细胞结构及细胞内和细胞外的表位会被严重地破坏。
[0009] 磷酸-表位，如p-Stat-5的常规检测方法需要使用醇类进行温育从而使这些表位 暴露。然而，醇类也可能会改变细胞结构和破坏细胞表面标记物。另外，醇类的使用限制了 后续的分析而且至少需要一个离心步骤从处理后的细胞中分离醇。
[0010] 每当包含红细胞的样品，例如外周血液样品，被用于分析时，这些红细胞的裂解是 很重要的但又很麻烦的步骤。由于全血中白细胞与红细胞的比例约为1/1000,优选的是需 要溶解全部的红细胞以能够区分或区别于白细胞。
[0011] 因此，本发明的根本技术问题在于提供一种用于处理固定的细胞、特别是白细胞 或其亚类的改善的组合物、方法和试剂盒，使得细胞内表位，例如磷酸-表位，可被各自的 特异性结合剂接近的同时维持细胞外表位对于相应的结合剂的可达性。存在对一种简便、 实用的用于同时对细胞外目标和细胞内难以暴露的目标，例如特定的磷酸-表位分析的方 法的需求。优选地，这种方法应该是快速的、易于自动化的、非劳动密集型的、不需要醇类处 理工序且允许使用结合剂混合物，包括针对细胞内和细胞外目标的结合剂的方法。
【发明内容】
[0012] 通过此处和权利要求中表征的实施例中所述的透化固定的细胞的细胞处理组合 物来实现解决上述技术问题的方案。
[0013] 本发明的一个方面涉及一种用于透化固定的血细胞的细胞处理组合物，其包含下 列物质的水溶液：
[0014] (a)至少一种阴离子表面活性剂，其以0. 3%至2% (w/v)之间的浓度被包含在所 述组合物中，其中所述阴离子表面活性剂的盐由式（1)表示：
[0015] Y-S03-X+ (1)
[0016] 其中，Y为R-0或R中的一种，R代表具有8至18个碳原子的烷基、亚烷基、芳基、 亚烷基-烷基、芳基-烷基或芳基-亚烷基的组，X代表一价阳离子，和
[0017] (b)血清白蛋白，其以0.2%至20% (w/v)之间的浓度被包含在所述组合物中，其 中所述细胞处理组合物的pH在约2至约6之间。
[0018] 根据本发明的这一方面，较高浓度的阴离子表面活性剂与细胞保护处理相结合， 即在酸性pH值下利用血清白蛋白。意外的是我们发现，在酸性pH下，血清白蛋白可与蛋白 质结合，以及提供充分的保护甚至可以对抗浓度增高的阴离子表面活性剂的强变性作用。 在较高PH值下，观察到血清白蛋白的这种保护作用不太明显。因此，根据本发明的实施例， 利用高度严谨的变性条件去变性和暴露否则很难接近的表位，例如特定的磷酸-表位，如 pStat-5、pStat-3、pStat_l、p-ERKl/2、或p_S6,同时在酸性pH下同时使用血清白蛋白可以 有效地保护被分析细胞的结构完整性和亚细胞组件。
[0019] 在优选的实施例中，所述细胞处理组合物包含pH在2至6之间的0. 2%至20% (w/v)的血清白蛋白，其中所述细胞处理组合物的pH为2至6,可以是2. 5至5. 5,可以是3 至5,可以是3. 5至4. 7,可以是4. 0至4. 4,通常约为4. 2。
[0020] 本发明所述的细胞处理组合物特别适于处理固定的血细胞。术语"固定的血细胞" 包含为了稳定整体的细胞和亚细胞结构，而使用足够的固定剂，即交联剂例如甲醛、多聚甲 醛、福尔马林或类似物处理的血细胞。技术人员熟悉适于此目的的固定剂。没有预先固定， 在本发明的细胞处理组合物所提供的严谨的变性条件下，细胞可能会被严重地破坏。
[0021] 在优选的实施例中，所述细胞处理组合物用于透化白细胞和暴露表位，特别是包 含在白细胞中的磷酸-表位。在使用细胞处理组合物前，利用包含浓度为2%至6%或3% 至5%，优选为约4% (w/v)的固定剂的甲醛或其它醛将来自外周血样品，例如全血样品中 的白细胞固定。该固定不仅保护细胞免于降解还可以将细胞冻结在磷酸化的状态，阻断磷 酸激酶和磷酸化酶的活性，这对于检测真实的激活，即被分析的磷酸-表位的磷酸化状态 来说是必要的。否则在后续的细胞处理步骤中，例如使用特异性结合剂标记所述细胞内和 /或细胞外结构，可能更改被分析细胞的激活方式，从而歪曲获得的结果。
[0022] 本发明所述的细胞处理组合物适于与固定的血细胞一起使用，尤其是白细胞（也 称为"白血细胞"）和多种白细胞的子类，包括但不限于单核白细胞、淋巴细胞、粒细胞、中性 粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。可以使用已知的技术从外周血或组织中，特别是从 哺乳动物，包括人类，小鼠，大鼠，山羊等中获得血细胞。本发明所述的细胞处理组合物特别 适于处理源于人的外周血液样品的固定的血细胞。源于合适的组织的样品的例子是鼠的脾 细胞。
[0023] 术语"阴离子表面活性剂（anionicsurfaceactiveagent) "也包含阴离子洗涤 剂（anionicdetergent)、阴离子表面活化剂（anionicsurfactant)、和阴离子表面活性 剂（anionictensides)。阴离子表面活性剂包含阴离子功能基团和亲水性部分。阴离子 功能基团优选为硫酸盐或磺酸盐。亲水性部分优选包含8~18个碳原子的烷基、芳基或烷 基_芳基。
[0024] 细胞处理组合物中包含相对较高含量的0.3%至2% (w/v)的所述阴离子表面活 性剂，两者其在细胞膜的透化以及"暴露"细胞内表位中均发挥主要作用。术语"暴露表位" 表示的应该是相对于"遮蔽"类型的表位，确立了或者至少提高了所述暴露的表位与相应的 可检测的标记的结合剂的可接近性。换句话说，"暴露"工序允许通过，例如抗体检测细胞结 构，而所述细胞结构在此工序之前不能被所述抗体识别。
[0025] 这里使用的术语"透化"是指在不破坏所述细胞整体结构的情况下，使细胞膜能够 透过大分子，如抗体和/或较大的荧光团，如藻红蛋白或别藻蓝蛋白或其偶联物的过程。
[0026] 本申请中的术语"表位"包含任意的可被特异性结合剂，例如多克隆抗体或单克隆 抗体或其免疫活性的片段，如F(ab) ' 2、Fab或Fab'片段识别的靶结合位点。"靶结合位点" 例如可以是蛋白质的至少一部分或在细胞内或表面存在的另一种分子的至少一部分。这里 使用的术语"特异性结合剂"表示能够识别并特异性结合仅仅一种或有限数量的类似表位， 并且基本不识别和不结合其他表位的结合剂。
[0027] 目前的临床研究集中在对细胞信号途径和它们的调控的分析上，例如对于药物施 用的响应。这种信号途径包含一种或多种限定的可激活的分子，通常是可磷酸化的信号蛋 白的激活，所述激活经常是特异性磷酸化。在本申请的范围内，术语"可激活的分子"描述的 是通过外在的影响，例如由另一个分子引发的磷酸化反应而被激活的分子，即从非活化状 态切换到活化状态的分子。因此，在一个例子中可激活的分子可能是在特定位置上可以被 磷酸化或去磷酸化的胞质蛋白。对磷酸化的分子，如磷酸蛋白的检测是高度需求的，但是这 种分子的特异性的磷酸化位点往往是"遮蔽"的且难以利用如对磷酸化位点具有特异性的 抗体来靶向。针对该问题，现有技术中的方法没有提出满意的解决方案。特别是磷酸-蛋白 的暴露和后续检测所必须的高度严谨的细胞处理条件的应用目前受限于以下事实：该（处 理）条件会容易地破坏或严重地破坏细胞结构和抗原位点的完整性。因此，严谨的细胞处 理条件的应用，例如使用大量的清洁剂迄今并不是合适的方案。
[0028] 术语"磷酸-表位"、"磷酸化的靶标"和"磷酸化位点"在本文中可以互换使用，其 表示的是细胞结构，优选细胞内蛋白的一个限定的位置，其可以以磷酸化或去磷酸化状态 存在。"磷酸-表位"可视作是特异性结合剂，如单克隆抗体，的处于活化状态的特异性识别 位点，所述特异性结合剂能够特异性识别磷酸化或去磷酸化的形式。通过检测"磷酸-表 位"的磷酸化状态，例如通过流式细胞法可以方便地研究基于细胞信号传导的磷酸化。
[0029] 根据本发明的一个实施例，细胞处理组合物包含至少一种阴离子表面活性剂的 盐，所述阴尚子表面活性剂选自由十^烷基硫酸纳（SDS)、十二烷基硫酸钟、十^烷基硫酸 铵和十二烷基苯磺酸钠构成的组。在优选的实施例中，包含在细胞处理组合物中的阴离子 表面活性剂是十二烷基硫酸，优选为SDS的形式。通常，式（1)的一价阳离子优选为选自由 Li+、Na+和K+和铵构成的组中的一种或多种。
[0030] 在实施例中，阴离子表面活性剂由式（1)表示，其中，R代表具有10至18个碳原 子的烷基、亚烷基、芳基、亚烷基-芳基、芳基-烷基或芳基-亚烷基。R优选代表具有12至 18个碳原子的烷基或芳基-烷基。
[0031] 在优选实施例中，阴离子表面活性剂如式（1)所示，其中，R代表具有8至16个碳 原子的烷基，优选具有10至14个碳原子的烷基。
[0032] 在实施例中，R代表直连或支链的烷基。在另一个实施例中，R包含苯基部分和烷 基部分，其中烷基部分为通过共价键与苯基部分连接的支链或直链。
[0033] 在实施例中，R包含具有12