0] 为了比较不同的阴离子表面活性剂，制备两种基于本发明的细胞处理组合物，一 种使用十二烷基硫酸钠（SDS)而另一种使用十二烷基苯磺酸钠（SDBS，Aldrich工业级，西 格玛化学公司，圣路易斯，密苏里州），其中两种试剂均以34. 7mM包含在细胞处理组合物 中。含有SDS的细胞处理组合物的pH值如实施例1所示。由于沉淀和稳定性的原因，含有 SDBS的细胞处理组合物的pH为5. 95且在加入全血样品之后上升至6. 6。否则，按照实施 例2A和2B所示处理并分析样品。
[0231] 如表4所示，对于p_Stat5两种试剂给出了相似的表达值。然而，相似含有SDBS 的试剂的细胞保护的效率较低。这可能是由于较高的PH会影响细胞保护。
[0232]表4
[0233]
[0234] 实施例5
[0235] 本实验将论证在酸性pH下血清白蛋白对于细胞和抗原的保护作用。基于这个原 因，制备如实施例1所示的若干细胞处理组合物，但是存在下列修改：
[0236] 1.实施例1的细胞处理组合物，其中省去BSA并由20mM的具有缓冲能力的酸性磷 酸盐代替，所述酸性磷酸盐具有与实施例1中的细胞处理组合物类似的浓度。该试剂的PH 为2. 5。2.实施例1的细胞处理组合物具有4. 15的pH。
[0237] 3.实施例1的细胞处理组合物，试剂的pH被调节至5. 6。
[0238] 4.实施例1的细胞处理组合物，试剂的pH被调节至6. 28。
[0239] 5.实施例1的细胞处理组合物，试剂的pH被调节至7. 4。
[0240] 除在固定之后使用PBS清洗样品之外，按照实施例2所述处理样品。
[0241] 在加入固定的细胞之后，分别将固定的血液和上述五种不同细胞处理组合物的混 合物的PH调节至下列值：
[0242] I.pH= 5. 7
[0243] 2.pH= 5. 7
[0244] 3.pH= 6. 4
[0245] 4.pH= 6. 7
[0246] 5.pH= 7. 0
[0247] ⑶14抗原对于变性条件特别地敏感且已经被选作保护参量。另外，单核细胞的侧 散射和回收细胞的数量被表示为参量。按照实施例2A和2B所示处理并分析全血液。
[0248] 待分析混合物在5. 7的pH下，观察到最强的保护作用。从表5看出，酸的作用和 血清白蛋白有关。在酸性条件下，没有血清白蛋白时，没有增加的保护。CD14的信号/噪声 比的计算如实施例2所示。
[0249]表5
[0250]
[0252] 酸性条件下的血清白蛋白似乎也可以提供额外的固定作用。与中性条件下血液裂 解之后单核细胞的侧散射值相比，在酸性条件下血液裂解之后单核细胞的侧散射值趋于变 高（参见表5)。较高的侧散射与血清白蛋白的是否存在无关。侧散射随着细胞的不透明性 和细胞中大分子聚集的量而增强。由于大分子聚集的量是细胞的固定强度的度量，因而可 以得出一个结论在酸性条件下使用血清白蛋白提供更好地固定作用。
[0253] 实施例6
[0254] 为了比较血清白蛋白相对于其它水溶性蛋白的保护作用，制备一种使用牛乳酪蛋 白（西格玛）代替BSA的替代细胞处理组合物。该细胞处理组合物中的其它成分与实施例 1中的试剂B相同。
[0255] 按照实施例2A所示处理并分析全血。
[0256] 从表6可以看出，对保护细胞表面抗原CD14而言，血清白蛋白优于酪蛋白。按照实 施例2所示计算CD14的信号/噪声比。单核细胞以及所有白细胞的侧散射值均被作为通过 BSA或酪蛋白为细胞蛋白提供的固定功能。再次，结果表明在BSA比酪蛋白更有效。另外， 当在细胞处理组合物中使用酪蛋白代替BSA时，获得的单核细胞以及所有白细胞的数量明 显降低，这表明血清白蛋白的保护作用优于酪蛋白。
[0257]表 6
[0258]
[0259] 实施例7
[0260] 在本发明的一些实施例中，细胞处理组合物可以包含离液序列高的盐例如高氯酸 盐或硫氰酸盐。为了说明如高氯酸钠的效果，制备下列细胞处理组合物：
[0261] (1)实施例1中的细胞处理组合物，其中省去高氯酸钠并由150mM的氯化钠代替。
[0262] (2)实施例1中的细胞处理组合物，其中省去高氯酸钠并由150mM的氯化钠代替。 并且将该试剂中SDS的浓度由1 %改为1. 5%。
[0263] (3)实施例1中的细胞处理组合物。
[0264] 按照实施例2A和B所示处理并分析全血液。按照实施例2A和B所示计算信号与 噪声比（s/n)。
[0265] 细胞处理组合物（1)中将高氯酸钠改为氯化钠导致红细胞的不完全裂解。这种效 应可以通过将细胞处理组合物中SDS的浓度提高至1. 5% (溶液（2))来补偿，可以产生与 (1)类似的裂解效果。另外，P_Stat5的表达也是类似的。然而，利用离液序列高的高氯酸 盐代替较高浓度的SDS在更好地保护CD14抗原方面的优势变得明显（参见表4)。
[0266]表 7
[0267]
[0268] 实施例8
[0269] 以下显示可在基于本发明的系统和方法中使用的示例性溶液。
[0270] 例如，用于固定基于本发明的全血的组合物可以是氯化钠（150mM)和不含甲醇的 甲醛（10% (w/v))的具有中性pH的水溶液。透过孔径尺寸为0.22ixm的尼龙过滤器过滤 该组合物。
[0271] 此外，用于裂解和变形基于本发明的全血的组合物可以是十二烷基磺酸钠 (34. 7Mm)、甲醇（I%v/v)、牛血清白蛋白（I%w/v)，磷酸二氢钠（2mM)、和高氯酸钠 (150mM)的水溶液。使用盐酸将pH调节至4. 2。
[0272] 通过混合除高氯酸钠之外的成分来制备根据本发明的用于裂解和变性固定的全 血的组合物。该体积应为终体积的85%。然后将pH调节至4. 4。将IM的高氯酸钠溶液加 入到终体积中。之后，充分地混合该组合物以溶解沉淀，以便获得4.2的最终pH。最后，透 过孔径尺寸为0. 22ym的尼龙过滤器过滤该组合物。
[0273] 此外，用于和抗体培养基于本发明的裂解并透化的细胞的组合物可以是4-(2-羟 乙基）哌嗪-1-乙磺酸（HEPES) (IOmM)、牛血清白蛋白（2% (w/v))、氯化钠（150mM)、和 Proclinl? 300 (0. 05% )的水溶液。混合后使用氢氧化钠将pH调节至7. 5。最后，透过孔径 尺寸为〇. 22ym的尼龙过滤器过滤该组合物。Proclin? 300来自Supelco公司，西格玛化 学公司，圣路易斯，密苏里州，美国。
[0274]用于清洗和保存基于本发明的抗体染色的细胞的组合物可以是磷酸盐缓冲液 (不含钾）、和不含甲醇的甲醛（0.5% (w/v))的水溶液。
【主权项】
1. 一种用于透化固定的血细胞的细胞处理组合物，其包含下列成分的水溶液： (a) 至少一种阴离子表面活性剂，其以0.3%至2% (w/v)之间的浓度被包含在所述组 合物中，其中所述阴离子表面活性剂的盐如式（1)所示： Y-S03 X+ (1) 其中，Y为R-0或R中的一种，R代表具有8至18个碳原子的烷基、亚烷基、芳基、亚烷 基-烷基、芳基-烷基或芳基-亚烷基，X代表一价阳离子，和 (b) 血清白蛋白，其以0. 2 %至20 % (w/v)之间的浓度被包含在所述组合物中， 其中所述细胞处理组合物的pH约在2和6之间。2. 如权利要求1所述的细胞处理组合物，其中所述阴离子表面活性剂以0. 6%至1. 5% (w/v)之间的浓度被包含在所述组合物中。3. 如权利要求1或2所述的细胞处理组合物，其中所述阴离子表面活性剂为十二烷基 硫酸钠（SDS)或十二烷基苯磺酸钠（SDBS)。4. 如上述权利要求中任一项所述的细胞处理组合物，其中所述血清白蛋白为哺乳动物 的血清白蛋白。5. 如权利要求4所述的细胞处理组合物，其中所述血清白蛋白为牛血清白蛋白。6. 如上述权利要求中任一项所述的细胞处理组合物，其中所述细胞处理组合物的pH 在3至5. 5之间。7. 如上述权利要求中任一项所述的细胞处理组合物，其中所述细胞处理组合物进一步 包含离液序列高的盐。8. 如权利要求7所述的细胞处理组合物，其中所述组合物包含浓度为20至250mM的离 液序列尚的盐。9. 如权利要求7所述的细胞处理组合物，所述离液序列高的盐包含高氯酸盐、硫氰酸 盐、或它们的组合。10. -种包含上述权利要求中任一项所述的细胞处理组合物和含有固定白细胞的生物 样品的组合，其中所述组合的pH值在5. 5至7之间。11. 如权利要求10所述的组合，所述生物样品包含全血、骨髓、或分离的白细胞的亚 群。12. 如权利要求10所述的组合，所述白细胞包含淋巴细胞或单核细胞。13. 如权利要求1至9中任一项所述的细胞处理组合物在处理含有固定白细胞的分离 的生物样品中的应用。14. 如权利要求13所述的细胞处理组合物的应用，其中所述固定的白细胞通过如权利 要求1至9中任一项所述的细胞处理组合物进行透化，并且通过至少一种对细胞内和/或 细胞外表位具有特异性的可检测地被标记的结合剂进行标记。15. 如权利要求13所述的细胞处理组合物的应用，其中所述生物样品包含全血、骨髓、 或分离的白细胞的亚群。16. 如权利要求13所述的细胞处理组合物的应用，其中所述白细胞包含淋巴细胞或单 核细胞。17. -种用于处理分离的生物样品的方法，所述样品包含至少白细胞，所述方法包含下 列步骤： (a) 固定步骤，其包含使所述生物样品与固定剂接触，其中加入足量的所述固定剂以实 现蛋白质、脂蛋白和核酸分子的至少部分交联； (b) 透化步骤，其包含使所述固定的生物样品与权利要求1至9中任一项所述的细胞处 理组合物相接触。18. 如权利要求17所述的方法，所述方法进一步包含： (c) 标记步骤，其包含使所述经透化的生物样品与至少一种对细胞内和/或细胞外表 位具有特异性的可检测地被标记的结合剂相接触。19. 如权利要求17至18中任一项所述的方法，所述方法包含在15°C和30°C之间的温 度下使用所述固定剂培养所述生物样品，其中优选培养所述样品5至15分钟。20. 如权利要求17至19中任一项所述的方法，所述方法包含在20°C和50°C之间的温 度下使用所述细胞处理组合物培养所述固定的生物样品，其中优选培养所述样品2至10分 钟。21. 如权利要求17至20中任一项所述的方法，所述方法包含清洗经过透化的生物样 品。22. 如权利要求17至21中任一项所述的方法，其中所述细胞处理组合物透化所述白细 胞并使所述白细胞的细胞内表位暴露。23. 如权利要求22所述的方法，其中所述细胞内表位包含磷酸表位。24. 如权利要求17至23中任一项所述的方法，所述生物样品包含全血、骨髓、或分离的 白细胞的亚群。25. 如权利要求17至23中任一项所述的方法，所述白细胞包含淋巴细胞或单核细胞。26. -种试剂盒，其包含： 如权利要求1至9中任一项所述的细胞处理组合物；和 包含血清白蛋白、和高氯酸盐或硫氰酸盐的细胞培养剂。27. 如权利要求26所述的试剂盒，所述细胞培养剂包含： pKa在中性pH范围内的缓冲液，其浓度为从1至50mM ; 血清白蛋白，其浓度为从0.2至20% (w/v); 高氯酸盐或硫氰酸盐，高氯酸盐或硫氰酸盐的浓度为从50至250mM ;和 防腐剂，防腐剂的浓度为从0.01至0.2% (v/v); 以及所述细胞培养剂的pH为从6至9。28. 如权利要求26或27所述的试剂盒，进一步包含含有甲醛的固定剂。29. 如权利要求26至28中任一项所述的试剂盒，进一步包含至少一种对细胞内表位具 有特异性的可检测地被标记的结合剂。30. 如权利要求26至29中任一项所述的试剂盒，进一步包含至少一种对细胞外表位具 有特异性的可检测地被标记的结合剂。31. 如权利要求26至30中任一项所述的试剂盒，进一步包含pH为从7至7. 5的清洗 组合物，所述清洗组合物包含： 磷酸盐缓冲液； 甲醛，甲醛的浓度为从0. 1至2% (v/v); 普朗尼克F68,普朗尼克F68的浓度为从0. 01至1 % (v/v);和 月桂酰肌氨酸盐，月桂酰肌氨酸盐的浓度为从0. 005至0. 05% (v/v)。
【专利摘要】本发明涉及一种用于透化固定的血细胞的细胞处理组合物、所述组合物的用途，和一种处理生物样品的方法，所述方法包含固定所述样品以及随后使所述生物样品与所述细胞处理组合物接触。本发明进一步涉及一种包含所述细胞处理组合物的试剂盒。
【IPC分类】G01N33/569, G01N1/30, G01N33/53
【公开号】CN105074418
【申请号】CN201380073830
【发明人】安德烈亚斯·凡·阿格索文
【申请人】贝克曼考尔特公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2013年12月23日
【公告号】CA2896535A1, EP2938993A1, US20140186858, WO2014105837A1