分离测定阿维a及其基因毒性杂质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析化学领域，具体涉及一种分离测定阿维A及其基因毒性杂质的方 法。
【背景技术】
[0002] 活性药物成分常包含有杂质，包括原料和合成工艺中所用的中间体的残留物和降 解物。由于它们本质上具有活性，一些原料、中间体或副产物可能是已知的或可疑诱变剂和 /或致癌物。此外，以前不可能进行的基因毒性杂质人类暴露和风险鉴定，随着分析技术的 进步现在也已经成为可能。假设人类暴露的最小化伴随着基因毒性杂质风险的最小化，那 么高敏感度分析法的有效性也伴以对可疑API残留的基因毒性杂质的测量和控制所增加 的关注。
[0003] 基因毒性杂质（或遗传毒性杂质，Genotoxic Impurity，GTI)是指化合物本身直 接或间接损伤细胞DNA，产生基因突变或体内诱变，具有致癌可能或者倾向。潜在基因毒性 的杂质（Potential Genotoxic Impurity，PGI)从结构上看类似基因毒性杂质，有警示性， 基因毒性物质特点是在很低浓度时即可造成人体遗传物质的损伤，进而导致基因突变并可 能促使肿瘤发生。因其毒性较强，对用药的安全性产生了强烈的威胁，需在药品的生产中进 行严格控制。所以，实现分离测定阿维A及其基因毒性杂质在阿维A的质量控制、安全性保 证具有极其重要的意义。
[0004] 阿维A是一种皮肤病用药，临床上用于治疗严重银肩病及角化不良症。其合成工 艺中用到低级醇，与阿维A形成潜在的基因毒性杂质阿维A甲酯和阿维A 丁酯，其结构式如 下：
[0005] 阿维A甲酯结构式：
[0006]
[0007] 阿维A 丁酯结构式：
[0008]
[0009] 对于制备阿维A工艺中可能引入的阿维A甲酯和阿维A 丁酯，因其具有基因毒性， 需在阿维A中进行严格控制。到目前为止，还没有公开的方法报道可高灵敏快速分离测定 阿维A及其基因毒性杂质。因此开发一种高灵敏快速有效分离测定阿维A及其基因毒性杂 质的方法，对于实现对阿维A中阿维A甲酯和阿维A 丁酯的分离及ppm级检测和控制，在阿 维A的质量控制、安全性保证具有极其重要的意义。
【发明内容】
[0010] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种分离测定阿维A及其基因毒性杂质的试剂 组合物及方法，该方法可快速同时实现阿维A及其基因毒性杂质的方法的分离和检测，精 密度和灵敏度高，为阿维A原料药和制剂的质量标准的制定及提高有重要的意义。
[0011] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0012] 用于固液分离测定阿维A及其基因毒性杂质的试剂组合物，由以下试剂组成：
[0013] 试剂A :酸性水溶液体系；
[0014] 试剂B :有机溶剂；
[0015] 所述酸性水溶液体系中冰乙酸的体积百分比为0. 5-1. 0% ;
[0016] 所述酸性水溶液体系与有机溶剂的体积比为：4_8 % :92-98 %。
[0017] 所述酸性水溶液体系中冰乙酸的体积百分比为0. 5-1. 0%，在此浓度范围内均能 很好地分离阿维A及其基因毒性杂质。
[0018] 进一步，所述有机溶剂为甲醇、乙腈和乙醇中的一种或多种。
[0019] 作为一种优选，所述有机溶剂为甲醇。
[0020] 本发明的目的之二在于提供一种用所述试剂组合物分离测定阿维A及其基因毒 性杂质的方法，具体包括以下步骤：
[0021] 1)配制供试样品溶液：取供试样品溶于四氢呋喃，再用有机溶剂稀释，得样品溶 液；
[0022] 2)配制流动相：
[0023] a配制所述试剂A得流动相A ;
[0024] b所述试剂B做流动相B ;
[0025] 3)将步骤1)所述样品溶液注入分离检测系统中，用步骤2)所述流动相对步骤1) 所述样品溶液进行洗脱分离得洗脱液；
[0026] 4)步骤3)所述洗脱液进入检测器测定。
[0027] 进一步，步骤1)所述供试样品与四氢呋喃的体积比为35-45% :5-15%。
[0028] 进一步，步骤1)所述样品溶液中阿维A的浓度为0. 3mg/ml-0. 5mg/ml。
[0029] 进样量和样品浓度会影响色谱柱分离效果和分析结果。进样量影响：进样量过大 会造成色谱柱超负荷，多组分色谱峰重叠，分离效果差；进样量过少，又会使含量低的组分 因检测器灵敏度不够而不出峰。最大允许的进样量应控制在峰高或峰面积与进样量呈线性 关系的范围内。
[0030] 进一步，步骤3)所述流动相流速为0. 5-1. 5ml/min。进样速度也会影响色谱柱分 离效果和分析结果。进样速度的影响：进样速度慢则会使色谱峰形加宽，影响分离效果。
[0031] 所述杂质包括阿维A甲酯和/或阿维A 丁酯，具体名称及结构为：
[0032] 阿维A甲酯结构式：
[0033]
[0034] 阿维A 丁酯结构式：
[0035]
[0036] 上述方法能快速同时实现阿维A与其基因毒性杂质的分离和检测，精密度和灵敏 度高，可在20分钟实现分离和检测。提供了现有技术未能解决的阿维A与其基因毒性杂质 的高灵敏测定问题，从而确保了阿维A及其制剂的质量可控，并最终确定产品的安全有效。
[0037] 本发明的目的还在于提供一种高效液相色谱法分离测定阿维A及其基因毒性杂 质的方法，具体包括以下步骤：
[0038] 1)配制空白溶液：取四氢呋喃用有机溶剂稀释，得空白溶液；
[0039] 2)配制供试样品溶液：取供试样品溶于四氢呋喃，再用有机溶剂稀释，得供试样 品溶液；
[0040] 3)配制基因毒性杂质对照溶液：取阿维A基因毒性杂质对照品，用有机溶剂稀释 溶解制成各个阿维A基因毒性杂质溶液（ppm级），得对照溶液；
[0041] 4)分别取步骤1)所述空白溶液、步骤2)所述供试样品和步骤3)所述对照溶液进 样，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，确定阿维A及其基因毒性杂质的保留时间，按杂 质限度法计算供试样品中阿维A及其基因毒性杂质的含量。
[0042] 检测中溶剂峰不干扰阿维A中阿维A甲酯和阿维A 丁酯的测定，且阿维A甲酯、阿 维A 丁酯和阿维A均能有效分离，分离度大于1. 5。
[0043] 进一步，步骤4)所述高效液相色谱分析采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的 色谱柱，色谱柱柱箱温度为25_35°C ;以酸性水溶液体系和有机溶剂作为流动相。
[0044] 十八烷基硅烷键合硅胶，完全球型、表面光滑的多孔硅胶，具有非常高的表面键合 覆盖率。一般用在高效液相色谱中的固定相。该硅胶整体柱键合效果良好，具有较好的反 相色谱性能，在pH 2-8之间稳定性好，柱压降、柱效受流速影响较小，可以达到快速、有效 的分离。
[0045] 进一步，步骤4)所述检测器的检测波长为350-380nm。
[0046] 进一步，所述色谱柱的规格为4. 6 X 150mm，5 μ m。
[0047] 本发明的有益效果在于：本发明用酸性水溶液体系及有机溶剂为流动相采用高效 液相色谱法分离测定阿维A及其基因毒性杂质，该方法在20分钟内可同时将阿维A及其基 因毒性杂质完全分离并进行检测；检测中溶剂峰不干扰阿维A中阿维A甲酯和阿维A 丁酯 的测定，且阿维A甲酯、阿维A 丁酯和阿维A均能有效分离，分离度大于1. 5 ;本发明中方法 简便可行，灵敏度高（达ppm级），分析时间短，专属性强，重现性好，可以有效测定阿维A及 其基因毒性杂质含量，提供了现有技术未能解决的阿维A及其基因毒性杂质的分离测定问 题，从而确保了阿维A及其制剂的质量可控，并最终确定产品的安全有效。
【附图说明】
[0048] 图1空白溶剂的高效液相色谱图。
[0049] 图2阿维A的高效液相色谱图。
[0050] 图3阿维A及阿维A甲酯及阿维A 丁酯的混合溶液高效液相色谱图。
[0051] 图4阿维A甲酯及阿维A 丁酯检测限测定的高效液相色谱图。
[0052] 图5阿维A中加入检测限浓度的阿维A甲酯及阿维A 丁酯的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0053] 以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具 体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说 明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明 内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0054] 以下实施例中，采用的仪器及色谱条件如下：
[0055] 高效液相色谱仪：岛津LC-2010AHT
[0056] 色谱柱：Shimadzu VP 0DS，4.6X150mm，5ym
[0057] 流动相：甲醇：0· 5%冰乙酸=95 :5
[0058] 检测波长：360nm
[0059] 流速：1.0ml/min
[0060] 柱温：25 °C
[0061] 进样量：100 μ 1
[0062] 稀释剂（溶解对照品和待测样品的溶剂）：30%乙腈。
[0063] 实施例1高效液相色谱法分离测定阿维A中基因毒性杂质的方法
[0064] 1)配制空白溶液：取四氢呋喃IOml置100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勾，即 得；
[0065] 2)配制供试样品溶液：取阿维A约40mg，精密称定，置100mL量瓶中，加IOml四氢 呋喃使溶解，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（〇.4mg/ml);
[0066] 3)配制基因毒性杂质对照储备液：分别精密称取阿维A甲酯9. 45mg (批号： 07032801)及阿维A 丁酯11. 65mg (批号：07032601)，置同一 50ml量瓶中，加5ml四氢呋喃 使溶解并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照储备液（阿维A甲酯（0. 189mg/ml)及阿维A 丁酯（0· 233mg/ml));
[0067] 4)配制基因毒性杂质对照溶液：取3)中的对照储备液逐级稀释，
[0068] 配制对照溶液（1):取上述对照储备液1.0 ml置100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻 度，摇勾，即得阿维A甲酯（1.89 μ g/ml)及阿维A 丁酯（2.33 μ g/ml)。
[0069] 配制对照溶液（2