一种乳腺癌细胞的染色方法及其应用和染色试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测技术领域，具体地涉及一种乳腺癌细胞的染色方法及其应用和染色试剂盒。
【背景技术】
[0002]乳腺癌患者远期生存的评价指标，包括原发灶的大小、腋窝淋巴结有无转移、肿瘤分子分型、以及是否有远处转移的证据等，这些指标对于患者群体的生存评价非常有意义，但对某些个体患者的风险判断的准确性相对有限。此外，在乳腺癌的随访期是通过体格检查、影像学等检查进行定期体检，等这些检查发现问题的时候其实已经错过了治疗的最佳时机。在乳腺癌的早期阶段，就有相当部分患者有微转移病灶(无法被常规医学检查发现的微小转移病灶)。既往研究发现微转移检测能够较目前随访检查手段更早反映患者远处转移的情况，而且微转移阳性患者较阴性患者预后更差。1979年，Heyderman通过免疫细胞化学(Immunocytochemistry，ICC)的方法检测到正常乳腺腺泡管腔膜上、乳腺癌细胞的细胞膜上和胞楽内广泛存在EMA (Epithelial Membrane Antigen)的表达。随后，Sloane入组了 43位出现远处转移的乳腺癌患者，从髂嵴收集骨髓标本加入EMA的抗体，通过ICC的方法首次发现有8位患者的骨髓标本中存在转移的单个肿瘤细胞和少量肿瘤细胞团。这些肿瘤细胞从原发灶脱离之后，通过淋巴和/或血液循环播散至远处靶器官，潜伏在靶器官中，进入休眠状态，形成微转移细胞/微转移灶。当机体内环境改变或在某些外界因素的作用下，这些休眠的微转移细胞开始重新增殖，最终形成临床检查可以发现的复发和转移病灶。目前，临床上通常将存在于血液系统的微转移细胞称为循环肿瘤细胞(Circulating TumorCell，CTC);定植于骨髓组织(Bone Marrow，BM)的则命名为播散肿瘤细胞(DisseminatedTumor Cell，DTC)0
[0003]如能提供一种简单的方法检测骨髓标本或血液标本中是否有乳腺癌微转移细胞，对于乳腺癌的预后判断和个体化治疗具有重要意义。
【发明内容】
[0004]发明目的:为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种操作简便、准确性好的用于检测乳腺癌细胞的染色方法。
[0005]本发明还要解决的技术问题在于提供一种用于检测血液中乳腺癌细胞的方法。
[0006]本发明进一步要解决的技术问题在于提供一种用于实现上述方法的染色试剂盒。
[0007]技术方案:为实现上述技术目的，本发明的用于检测乳腺癌细胞的染色方法包括如下步骤:
[0008](I)将体外培养的乳腺癌细胞株平铺到载玻片表面；
[0009](2)以小鼠抗人广谱细胞角蛋白抗体(小鼠抗人Ant1-pan Cytokeratinantibody[AE1/AE3])为一抗，将其与步骤⑴得到的平铺细胞的载玻片于37°C温箱中孵育I?2h，PBS洗漆3?4次，每次3?4min ；
[0010](3)以辣根过氧化物酶标记(HRP Polymer Conjugate)兔抗鼠抗体为二抗，将步骤⑵得到的载玻片与所述二抗于常温下孵育25?30min，PBS洗涤3?4遍，每次3?4min ；
[0011](4)向步骤(3)得到的载玻片上滴加新鲜配制的DAB棕色显色液，室温下静置5?8min，待在低倍镜(1X)下视野内细胞呈现棕色染色后用水洗涤终止反应；
[0012](5)用苏木素复染步骤(4)得到的载玻片30?40s，用自来水洗涤至水清澈后，用I %盐酸乙醇分色ls，然后水浸洗I?1.5min，依次浸入85% (v/v)乙醇、95% (v/v)乙醇、无水酒精中各3?4min，最后浸没到二甲苯中5?6min，从二甲苯中取出载玻片后风干，在载玻片半干时，滴加中性树胶封片液，封片保存，然后置于显微镜下观察。
[0013]其中，表面平铺乳腺癌细胞的载玻片的制备方法如下:
[0014]I)胰酶消化体外培养的乳腺癌细胞株，PBS溶液洗涤和混匀。
[0015]2)打开离心机，将含有乳腺癌细胞株的PBS加入样本孔，使得每个样本孔的总细胞量在0.2?0.5M个，优选地，控制每个样本孔的总细胞量为0.3M个，此时，细胞在载玻片上可以分布均匀，密度适中，便于镜下观察，过多时即会出现细胞重叠现象。离心后吸弃PBS溶液，得到表面平铺乳腺癌细胞的载玻片；
[0016]3)将上述载玻片风干后，丙酮固定8?1min ；
[0017]4)在组织周围用免疫组化笔画圈，圈线离组织3mm左右；
[0018]5) PBS洗涤3?4min，然后用3?5wt% H2O2室温浸泡8?lOmin，最后用PBS洗涤3?4遍，每次3?4min即得。
[0019]其中，步骤(2)中，Hettich离心机离心的条件为2500?2800rcf，6?8min。
[0020]其中，步骤(4)中，所述的DAB棕色显色液通过如下步骤制备:850ul去离子水中依次加入DAB显色试剂盒(福建迈新，货号DAB-0031)中的A液(DAB缓冲液)和B液(DAB底物)和C液(DAB色原)各50ul，混匀后避光备用。
[0021]步骤(5)中，所述的1%盐酸乙醇通过如下方法配制:75% (v/v)的乙醇中加入36.5wt%?38界1:%浓盐酸中，其中，75% (v/v)的乙醇与36.5wt%?38界1:%浓盐酸的体积比为100: 10
[0022]进一步地，本发明提出了上述方法在检测血液中乳腺癌细胞中的应用。
[0023]具体地，检测血液中乳腺癌细胞包括如下步骤:
[0024](I)提取血液样品中的单核细胞层细胞，制备表面平铺细胞的载玻片；其中，提取血液样品中的单核细胞层细胞采用公知的方法，如包括下述步骤:
[0025](A):用肝素钠抗凝管收集外周血标本，离心，吸弃上层血浆，得到血细胞；
[0026](B):将步骤A得到的血细胞用PBS稀释混匀后，加入预先放置了淋巴细胞分离液的离心管中，离心后取上清和淋巴细胞分离液之间的液体即为单核细胞层细胞，将所述单核细胞层细胞加入PBS溶液中洗涤，离心后加入PBS缓冲液混匀备用；
[0027]制备表面平铺细胞的方法同上述制备表面平铺乳腺癌细胞的步骤相同。
[0028](2)以小鼠抗人广谱细胞角蛋白抗体为一抗，将其与步骤(I)得到的表面平铺乳腺癌细胞的载玻片于37°C温箱中孵育I?2h，PBS洗涤3?4次，每次3?4min ;
[0029](3)以辣根过氧化物酶标记兔抗鼠抗体为二抗，将步骤(2)得到的载玻片与所述二抗于常温下孵育25?30min，PBS洗涤3?4遍，每次3?4min ；
[0030](4)向步骤(3)得到的载玻片上滴加新鲜配制的DAB棕色显色液，室温下静置5?8min，待在低倍镜下视野内细胞呈现棕色染色后用水洗涤终止反应；
[0031](5)用苏木素复染步骤(4)得到的载玻片30?40s，用水洗涤至水清澈后，用1%盐酸乙醇分色ls，然后水浸洗I?1.5min，依次浸入85% (v/v)乙醇、95% (v/v)乙醇、无水酒精中各3?4min，最后浸没到二甲苯中5?6min，从二甲苯中取出载玻片后风干，在载玻片半干时，滴加中性树胶封片液，封片保存，然后置于显微镜下观察。
[0032]其中，优选地，所述的血液细胞为外周血细胞或骨髓细胞。
[0033]本发明进一步提出了一种用于实施上述染色方法的试剂盒，包括盒体、盒盖、载玻片、装有小鼠抗人广谱细胞角蛋白抗体的一抗试剂瓶、装有辣根过氧化物酶标记兔抗鼠抗体的二抗试剂瓶、DAB显色试剂组、DAB显色液储瓶、装有苏木素的复染液试剂瓶、装有1%盐酸乙醇的分色液试剂瓶、装有中性树胶的封片液试剂瓶，其中，所述的盒体包括上下两层，其中，下层被分隔为两个空腔，两个空腔内分别设置有可抽拉的抽屉，其中，所述的载玻片设置于其中一个空腔内，所述的DAB显色试剂组设置于另一个空腔内；所述的DAB显色试剂组包括装有DAB缓冲液的试剂瓶、装有DAB底物的试剂瓶和装有DAB色原的试剂瓶；所述盒体的上层被分隔成六个分区，分别用于放置一抗试剂瓶、二抗试剂瓶、DAB显色液储瓶、复染液试剂瓶、分色液试剂瓶和封片液试剂瓶。由于载玻片和DAB显色试剂组在一次测试中使用频率不高，通过将载玻片和DAB显色试剂组设置于试剂盒的下层，可以避免在取用其他试剂时造成对它们的污染。
[0034]优选地，所述的DAB显色液储瓶为棕色储瓶。
[0035]有益效果:本发明通过以小鼠抗人广谱细胞角蛋白抗体(AE1/AE3)为一抗，以辣根过氧化物酶标记兔抗鼠抗体为二抗，通过DAB和苏木素染色，使得血液中的乳腺癌细胞被特异性染色。本发明的方法操作简单，准确性好，具有较好的应用前景，可用于乳腺癌患者骨髓血和外周血标本中乳腺癌微转移细胞的检测，对乳腺癌的预后具有重要参考意义。
【附图说明】
[0036]图1为乳腺癌细胞株MCF-7的染色效果图。
[0037]图2为含有乳腺癌细胞株MCF-7的外周血染色效果图(2A为含有MCF-7的外周血染色效果图，2B为不含有MCF-7的外周血染色效果图)。
[0038]图3为含有乳腺癌细胞株MCF-7的骨髓血染色效果图(3A为含有MCF-7的骨髓血染色效果图，3B为不含有MCF-7的骨髓血染色效果图)；
[0039]图4为本发明的试剂盒的结构示意图。
【具体实施方式】
[0040]本发明提供了一种用于检测乳腺癌细胞的试剂盒，如图4所示，包括盒体1、盒盖
2、载玻片、装有小鼠抗人广谱细胞角蛋白抗体的一抗试剂瓶3、装有辣根过氧化物酶标记兔抗鼠抗体的二抗试剂瓶4、DAB显色试剂组、DAB显色液储瓶5、装有苏木素的复染液试剂瓶
6、装有1%盐酸乙醇的分色液试剂瓶7、装有中性树胶的封片液试剂瓶8，其中，所述的盒体包括上下两层，其中，下层被分隔为两个空腔，两个空腔内分别设置有可抽拉的抽屉，每个抽屉外壁设置有拉环9，其中，所述的载玻片设置于其中一个空腔内，所述的DAB显色试剂组设置于另一个空腔内；所述的DAB显色试剂组包括装有DAB缓冲液的试剂瓶、装有DAB底物的试剂瓶和装有DAB色原的试剂瓶。盒体的上层被分隔成六个分区，分别用于放置一抗试剂瓶3、二抗试剂瓶4、DAB显色液储瓶5、复染液试剂瓶6、分色液试剂瓶7和封片液试剂瓶8。由于载玻片和DAB显色试剂组在一次测试中使用频率不高，通过将载玻片和DAB显色试剂组设置于试剂盒的下层，可以避免在取用其他试剂时造成对它们的污染。
[0041 ] 样品及试剂来源:
[0042]乳腺癌细胞株为MCF-7，购自上海中科院细胞库，一抗为即用型abeam小鼠抗人广谱细胞角蛋白抗体(小鼠抗人Ant1-pan Cytokeratin antibody [AE1/AE3]，货号ab80826)，二抗为辣根过氧化物酶标记兔抗鼠二抗(福建迈新，货号878973)。
[0043]试剂的配制:
[0044](I)PBS缓冲液的配制:0.0lM的PBS粉剂，加入2000m