AQ5)对细胞核染色，在 样品中定量或估测细胞数目。
[0039] 在另一实施方案中，检测结合至致病蛋白质聚集体的探针包括于样品池或微量滴 定板中，测量非血浆血液成分的样品中结合至致病蛋白质聚集体的荧光或吸光度。
[0040] 在另一实施方案中，检测结合至致病蛋白质聚集体的探针包括在包含非血浆元素 的样品的全部或部分2维场中测量结合至致病蛋白质聚集体的探针的荧光或吸光度。
[0041] 本公开也涉及一种用于评估来源于个体的非血浆血液成分的方法，所述个体疑似 患有与异常蛋白质聚集相关的疾病，所述方法包括：
[0042] a)从个体中获取测试血样，
[0043] b)从所述测试血样中分离非血浆血液成分，
[0044] c)将所述非血浆血液成分与结合至非血浆血液成分中的致病蛋白质聚集体的探 针接触，以及
[0045] d)检测结合至致病蛋白质聚集体的探针，
[0046] 其中所述非血浆血液成分中致病蛋白质聚集体的存在表明所述个体患有与异常 蛋白质聚集相关的疾病。
[0047] 在一个实施方案中，所述非血浆血液成分是白细胞、微泡和/或血小板。在一个实 施方案中，所述非血浆血液成分是白细胞或血小板。
[0048] 在一个实施方案中，所述探针是荧光探针，任选地为构象敏感的探针。
[0049] 在另一实施方案中，所述探针是刚果红、刚果红衍生物、K114、X34、BSB、FSB、niSB、 柯胺-G、甲氧基-X34、甲氧基-X04、硫磺素-T、硫磺素-S、匹兹堡化合物B、噻嗪红R、金 胺-〇、p-FTAA或与p-FTAA有关的发光共辄聚噻吩（LCP)或发光共辄寡聚噻吩（LC0)。
[0050] 在另一实施方案中，检测结合至致病蛋白质聚集体的探针包括检测结合至致病蛋 白质聚集体的探针的荧光或吸光度。
[0051] 在另一实施方案中，如在此所述，检测荧光或吸光度包括检测荧光信号的强度，产 生荧光发射光谱或产生吸收光谱。
[0052] 在另一实施方案中，与异常蛋白质聚集相关的疾病选自由下列疾病组成的组：阿 尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏症、轻度认知缺损、大脑淀粉样血管病、肌病、神经病、 脑外伤、额颞痴呆、皮克氏病、多发性硬化、朊病毒病、唐氏综合征和ALS。
[0053]在另一实施方案中，所述致病蛋白质聚集体包括淀粉样蛋白、任选地为淀粉 样蛋白、α-突触核蛋白、亨廷顿蛋白（huntingtin)、微管相关蛋白、高度磷酸化的微管相 关蛋白（pTau)、H元病毒蛋白、αΒ_晶状体蛋白（CRYAB)、结蛋白、砸蛋白、肌动蛋白、肌球蛋 白和/或超氧化物歧化酶（S0D)。
[0054] 在另一实施方案中，所述致病蛋白质聚集体包括β-淀粉样蛋白，所述疾病是阿 尔茨海默氏病。
[0055] 本公开也涉及一种用于分析非血浆血液成分，以检测与异常蛋白质聚集相关的疾 病的试剂盒，所述试剂盒包括：
[0056] (a)探针，其用于检测非血浆血液成分中致病蛋白质聚集体的存在和
[0057] (b)使用说明。
[0058] 在一个实施方案中，所述探针是荧光探针，任选地为刚果红、刚果红衍生物、K114、 X34、BSB、FSB、頂SB、柯胺-G、甲氧基-X34、甲氧基-X04、硫磺素-T、硫磺素-S、匹兹堡化合 物B、噻嗪红R、金胺-〇、p-FTAA或与p-FTAA有关的发光共辄聚噻吩（LCP)或发光共辄寡聚 噻吩（LC0)。
[0059] 在另一实施方案中，所述与异常蛋白质聚集相关的疾病选自由下列疾病组成的 组：阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏症、轻度认知缺损、大脑淀粉样血管病、肌病、神 经病、脑外伤、额颞痴呆、皮克氏病、多发性硬化、朊病毒病、唐氏综合征和ALS。
[0060] 在另一实施方案中，所述致病蛋白质聚集体包括淀粉样蛋白、任选淀粉样蛋 白、α-突触核蛋白、亨廷顿蛋白、微管相关蛋白、高度磷酸化的微管相关蛋白（pTau)、朊病 毒蛋白、αB-晶状体蛋白（CRYAB)、结蛋白、砸蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白和/或S0D。
[0061] 在一个实施方案中，所述试剂盒对检测个体中与异常蛋白质聚集相关的疾病是有 用的。在另一实施方案中，所述试剂盒对评估来自个体的非血浆血液成分（例如白细胞） 是有用的，所述个体疑似患有与异常蛋白质聚集相关的疾病。在一个实施方案中，所述试剂 盒对（例如通过使用在此所述的方法）检测来自于个体的血样中的致病蛋白质聚集体是有 用的。
[0062] 通过下文的详细描述，本公开的其它特征和优势将是显而易见的。但是应理解的 是，在指出优选的实施方案时，说明和具体实施例仅通过例证的方式给出，因为通过多个实 施方案的这种描述，处于本公开的精神与范围内的各种改变和变形对于本领域普通技术人 员将是显而易见的。
【附图说明】
[0063] 下文中描述了关于附图的实施方案，其中：
[0064] 图1描述了X-34的光谱荧光图像，所述X-34为荧光淀粉样蛋白探针（Styren等 人，2000)，其结合至5xFADAD转基因小鼠脑的福尔马林固定切片中的老年斑块，为每个像 素收集光谱分辨数据的12个通道。a)显示出淀粉样蛋白斑块的典型形态和斑块"成熟"的 两种状态的分解图像。b)从斑块和数学分解操作所使用的激光后向散射中测量的发射光 谱。如C和d所示，X-34图像中大淀粉样蛋白斑块的中心和边界的密集发射被很好地分离。 这些结果阐明不仅能检测脑中淀粉样蛋白斑块的能力，也能在单个斑块中区分多种聚集状 态的能力。
[0065] 图2示出了 5xFAD小鼠脑的福尔马林固定切片的抗-Αβ(6E10)免疫荧光。a)老 年斑块的典型形态，其为6E10免疫-阳性（星号）。也在血管周围观察到6E10-阳性血细 胞（正方框（squarebox))。b)a中正方框的高放大倍数图像，表明白细胞包含为Αβ的物 质。
[0066] 图3示出了小鼠血沉棕黄层样品中具有6Ε10免疫荧光的Χ-34的双标记。a-c)来 自循环血的5xFAD小鼠血沉棕黄层中具有6E10免疫荧光的分解X-34图像。用6E10免疫 荧光信号清楚地共定位（c〇-localized)X-34-阳性细胞。d)X-34-阳性5xFAD小鼠血沉棕 黄层白细胞的发射光谱。来自循环血的X-34-阳性白细胞的测量的发射光谱实际上与来自 5xFAD小鼠脑中的老年斑块（虚线）的那些是相同的，表明白细胞包含与斑块中所发现的那 些非常相似的物质。
[0067] 图4示出了X-34的2-光子光谱荧光图像，所述X-34结合至来自健康对照（HC) 和AD患者的血沉棕黄层的类淀粉样蛋白物质。a)真彩色（左列）、分解的自体荧光（灰 色）和AD-特异性X-34 (白色）通道（中和右列）。仅从AD血沉棕黄层中检测到AD特异 性X-34信号。b)AD-特异性X-34信号和自体荧光的发射光谱。c)仅在AD白细胞中显示 出强的AD-特异信号的柱状图。CJD指患有克雅氏病（Creutzfeldt-Jakob)的患者。
[0068] 图5示出了使用淀粉样蛋白探针X-34的双标记，所述探针具有来自健康对照（HC) 和AD患者的血沉棕黄层中的抗-Aβ抗体^E10)。AD-特异性X-34信号（详见图4)仅在 AD白细胞（f)中是强的，其与强Αβ免疫标记（g)共定位。但是仅有部分AD白细胞是阳 性的。相反，在健康对照的血沉棕黄层中仅观察到非常弱的背景信号（b、c)。激光后向散 射方便地鉴别出每个细胞（d、h)，使用在此所描述的光谱技术，该信号被完美地从其他发射 (信号）中分离。
[0069] 图6示出了K114的光谱荧光图像，其为另一种荧光淀粉样蛋白探针（Crystal 2003)，结合至健康对照（HC)和AD患者的血沉棕黄层中的类淀粉样蛋白物质上。a)真彩色 (左列），分解的自体荧光和AD-特异性K114通道（右列）。b)HC-、AD-特异性K114信号 和自体荧光的发射光谱。
[0070] 图7是反映个体患有AD还是轻度认知缺损（MCI)的可能性的简化综合指数（"ADR 指数"即"AD相关指数"）。使用淀粉样蛋白探针K114标记从患者获取的白细胞并根据上 文进行波谱分析。
[0071] 图8示出了以刚果红染色的多发性硬化患者的人脑。这些数据表明慢性MS斑块 具有淀粉样蛋白沉积，其在血液白细胞中，以与AD相似的方式，应是可检测的。
[0072] 图9示出了由血液（图9A)和脑（图9B)样品以及野生型（WT)对照样品的波谱分 析获得的AD指数，所述血液和脑样品来自1月、2月、3月和10月的患有阿尔茨海默氏病的 转基因小鼠模型（5xFAD)，所述野生型（WT)对照样品使用如实施例6中所述的探针K114。
[0073] 图10示出了对比于实施例7中所述的健康对照（HC)，通过分析来自诊断患有阿尔 茨海默氏病（AD)的个体的血液所获取的光谱图。
[0074] 图11示出了白细胞的染色，所述白细胞获取自具有42抗体和致病蛋白质聚集 体（K114)探针的健康对照（图11A)和患有阿尔茨海默氏病（AD)的个体（图11B)。健康 对照和AD个体均显示出Αβi42染色，但是对于K-114,图11B显示出更高水平的染色，表明 致病蛋白质聚集体的存在。白细胞通常显示出小的亮的包涵体以及更弥散的胞液染色，它 们对于淀粉样蛋白探针标记均是阳性的。所述包涵体在健康对照和AD血液中均出现，但是 在AD样品中数目更多，并显示出独特的光谱特征；另一方面胞液标记在AD样品中更强，实 际上在健康对照白细胞中是检测不到的。Αβi42免疫标记白细胞的子集，既标记颗粒体也 标记弥散的胞液。图11C示出Αβ142免疫标记的总体强度在AD对健康对照（HC)中是相似 的。
[0075] 图12示出了与获取自阿尔茨海默氏病（AD)的个体和健康对照（HC)的光谱相比， 通过使用结合至致病蛋白质聚集体（Κ-114)的探针，分析来自外伤性脑损伤（ΤΒΙ)后5天 仍处于昏迷的个体的白细胞所获取的光谱。
[0076] 图13示出了以Κ-114进行的血小板染色，所述血小板获取自野生类型对照和 5xFAD小鼠。图13Α和13Β示出了Κ114真彩色图像，而图13C和13D示出了分解的Κ114图 像。图13E示出了Αβ-特异性K114信号的发射光谱和自体荧光。与野生型对照血小板相 比，5xFAD血小板显示出更高的Αβ-特异性Κ114信号（图13Β和13D)。
[0077] 发明详沐
[0078] 发明人已发现来自于AD个体的非血浆血液成分中淀粉样蛋白探针荧光的光谱特 征与那些来自于人类和小鼠脑的老年斑块高度相似，因此证明非血浆血液成分包含与脑斑 块中所发现的物质相似的物质。不被任何理论所限制，假定暴露于致病蛋白质聚集体的非 血浆血液成分（例如白细胞、血小板和/或红细胞）使这些聚集体累积。本发明的方法将 循环的非血浆血液成分中致病蛋白质聚集体的存在和与异常蛋白质聚集相关的疾病的诊 断相关联。本发明也描述了用于在非血浆血液成分中检测和/或识别致病蛋白质聚集体的 方法。
[0079]因此，本公开的一方面提供了一种在个体中检测与异常蛋白质聚集相关的疾病的 方法，其中个体的非血浆血液成分的致病蛋白质聚集物的存在表明所述个体患有与异常蛋 白质聚集相关的疾病。本公开的另一方面提供了通过将样品与结合至致病蛋白质聚集体的 探针接触，任选通过光谱分析在样品中识别所述致病蛋白质聚集体的类型或组成，在来自 个体的血样中用于检测致病蛋白质聚集体的方法。
[0080] 如本文所使用的，术语"与异常蛋白质聚集相关的疾病"指与蛋白质错折叠和聚集 相关和/或以蛋白质错折叠和聚集为特征的任何疾病。在这样的疾病中，所述蛋白质可从 它们的可溶的功能状态错折叠和聚集至具有高折叠（β-sheet)含量的高度有序的纤 维组装体（"淀粉样肽"或"淀粉样蛋白"）。而"与异常蛋白质聚集相关的疾病"可能根本 是不相关的，它们共同之处在于结合至淀粉样蛋白探针，例如刚果红。所述与异常蛋白质聚 集相关的疾病包括，但不限于：阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏症、轻度认知缺损、 大脑淀粉样血管病、脑外伤、额颞痴呆、皮克氏病、多发性硬化、朊病毒病、唐氏综合征和肌 萎缩侧索硬化（ALS)。其他与异常蛋白质聚集相关的疾病包括神经肌肉障碍，例如肌病（例 如结蛋白肌病、α-B晶状体蛋白肌病、硒蛋白肌病、遗传性包涵体肌病、肌动蛋白肌病、肌球 蛋白肌病）（Vicart等人，1998)和神经病（例如家族性淀粉样变性神经病变）（Sharma和 Goebel2005)。与异常蛋白质聚集相关的疾病也包括神经障碍和/或神经变性障碍。与异 常蛋白质聚集相关的疾病不限于本文所列举的具体疾病；使用本文所描述的方法，可以检 测任何包含将错折叠蛋白质聚集作为其一部分的疾病。
[0081] 在不同的疾病中，不同的蛋白质可以被错折叠和聚集。例如，阿尔茨海默氏病以包 含在脑组织中积聚的斑块的淀粉样蛋白为特征。在帕金森氏症中见到α-突触核蛋白 (α-Syn)神经元包涵体。亨廷顿氏症与亨廷顿蛋白的聚集相关。对朊病毒病（例如传染性 海绵状脑病、牛海绵状脑病和克雅氏病（CJD))(的发生）负有责任的传染性试剂是朊病毒 蛋白的错折叠和聚集形式。此外，本公开的发明人有证据表明在多发性硬化症患者的脑中 发现淀粉样蛋白沉积。
[0082] 如本文所使用的，术语"致病蛋白质聚集体"指体内存在的蛋白质和多肽的毒性错 折叠和聚集形式。如本文所使用的，术语"蛋白质聚集体"至错折叠的肽或蛋白质低聚物，其 包括肽二聚体和大于二聚体的低聚物。"致病蛋白质聚集体"的实例包括淀粉样蛋白。"淀 粉样蛋白"是用于描述不溶的纤维状蛋白质聚集体的一般术语。致病蛋白质聚集体也可包 括可溶的聚集体，例如淀粉样蛋白低聚物。所述致病蛋白质聚集体可由单一蛋白质或 多个不同的蛋白质构成。所述致病蛋白质聚集体也可包含脂质和核酸成分。可在致病蛋 白质聚集体中发现的蛋白质的实例包括但不限于：β-淀粉样蛋白、a-突触核蛋白、亨廷 顿蛋白、微管相关蛋白、高度磷酸化的微管相关蛋白（pTau)、朊病毒蛋白、aB-晶状体蛋白 (CRYAB)、结蛋白、硒蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白以及超氧化物歧化酶（S0D)。
[0083] 如本文所使用的短语"在个体中检测与异常蛋白质聚集相关的疾病的方法"指一 种测定个体是否患有与异常蛋白质聚集相关的疾病的方法或过程。短语"在个体中检测与 异常蛋白质聚集相关的疾病的方法"也指一种测定个体是否具有与异常蛋白质聚集相关的 疾病的提高的发病风险的方法。本文所使用的术语"风险"和"提高的风险"指所述个体具 有发病的倾向，例如与人口一般风险相比提高的风险。短语"检测疾病"也指在未出现症状 的患者中检测疾病。"检测疾病"也包括检测所述疾病的阶段、严重程度、亚型或进展。
[0084] 在一个实施方案中，本文所描述的方法包括从个体中获取血样。获取血样的方法 是本领域所熟知的。在一个实施方案中，所述样品包括血液、全血或其中一部分。在另一个 实施方案中，所述血样包括血沉棕黄层。在另外的实施方案中，所述血样包括白细胞。如本 文所使用的"非血浆血液成分"指除了血浆外的血液成分（例如红细胞、白细胞、微泡和血 小板）。
[0085] 血沉棕黄层是血液密度梯度离心后的抗凝血样品部分。所述血沉棕黄层包含血