丁峰。
[0086] 图2显示为本发明的银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分在不同液相梯度洗脱条 件下的液相色谱图。
[0087] 图3显示为本发明的银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分在不同浓度的磷酸水溶 液选择下的液相色谱图，其中，1 :〇. 1%磷酸水溶液，2 :0. 2%磷酸水溶液，3 :0. 3%磷酸水 溶液，4 4%磷酸水溶液。
[0088] 图4显示为本发明的银杏酮酯中45种黄酮类和有机酸类成分的液相色谱图。
【具体实施方式】
[0089] 下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的保护范围。
[0090] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0091] 以下实施例使用的试剂和仪器如下：
[0092] 1、试剂
[0093] 乙腈（色谱纯，Merck公司）；甲醇、磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限责任公 司）；水（纯净水）；芦丁（纯度为90. 5%，中国药品生物制品检定所）、槲皮素（纯度为 99. 1 %，中国药品生物制品检定所）、山奈素（纯度为93. 2%，中国药品生物制品检定所）、 异鼠李素（纯度为99.0%，中国药品生物制品检定所）；
[0094] 银杏酮酯，由上海杏灵科技药业股份有限公司提供，共18批银杏酮酯，批号见下 表2。
[0095] 表2银杏酮酯批号
[0097] 2、仪器
[0098] Agilent 1260型高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器（美国Agilent公司）； BS IlOS型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；Sartorius BP 211D型电子天平 (Sartorius，Germany) ;V0RTEX1 型祸旋混合器（IKA，Germany);微量移液器（Eppendorf， Germany) ;DC-200H型超声波清洗仪（DELTA，中国台湾）；SHA-C型水浴恒温振荡器（江苏金 坛市环宇科学仪器厂）；Acquity型高效液相色谱仪（美国Waters公司）、Xevo G2-XS型电 喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱仪（美国Waters公司）！Agilent Poroshell 120 SB C18柱（美国Agilent公司）
[0099] 实施例1
[0100] 1、实验部分
[0101] 1.1样品前处理
[0102] 供试品溶液的制备：精密称取银杏酮酯100mg，置于15ml离心管中，精密加入 10-90 %甲醇水溶液优选为60 %甲醇水溶液，使料液比为I :80-120 (g/ml)，优选精密加 入60%甲醇IOml (使料液比为I :100(g/ml))，密闭后在转速为2500-3000r/min优选为 2800r/min下，祸旋提取3-10min优选为5min，用孔径为0. 45 μ m的滤膜过滤，取续滤液，即 得供试品溶液。
[0103] 参照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品适量，精密加入10-90 %甲醇水溶液优 选为60%甲醇水溶液溶解并定容，配成已知浓度200-300 μ g/ml的参照品溶液，参照品溶 液中芦丁的浓度优选为250 μ g/ml。
[0104] 对照品溶液的制备：分别精密称取如表1所示的45种黄酮类和/或有机酸类成分 对照品中的任意一种或多种对照品，优选芦丁、槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品中的一种 或多种对照品，精密加入10-90%甲醇水溶液优选为60%甲醇水溶液溶解并定容，即得单 一对照品溶液或者混合对照品溶液。
[0105] 其中，配制单一对照品溶液，分别精密称取芦丁、槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品 中任意一种适量，精密加入10-90%甲醇水溶液优选为60%甲醇水溶液溶解并定容。芦丁 的单一对照品溶液中芦丁的浓度为3. 91-1000 μ g/mL ;槲皮素的单一对照品溶液中槲皮素 的浓度为〇. 63-80 μ g/mL ;山奈素的单一对照品溶液中山奈素的浓度为0. 39-50 μ g/mL ;异 鼠李素的单一对照品溶液中异鼠李素的浓度为〇. 23-15 μ g/mL。
[0106] 其中，配制混合对照品溶液，混合对照品溶液为芦丁、槲皮素、山奈素、异鼠李素中 任意两种以上的混合对照品溶液，其中，芦丁的浓度为3. 91-1000 μ g/mL、槲皮素的浓度为 0. 63-80 μ g/mL、山奈素的浓度为0. 39-50 μ g/mL、异鼠李素的浓度为0. 23-15 μ g/mL。
[0107] 具体配制时，分别精密称取芦丁、槲皮素、山奈素对照品中的任意一种或多种适 量，精密加入10-90%甲醇水溶液优选为60%甲醇水溶液溶解并定容，获得第一混合母液； 再精密称取异鼠李素对照品，精密加入10-90 %甲醇水溶液优选为60 %甲醇水溶液溶解并 定容，获得第二混合母液；再将第一混合母液与第二混合母液等量混合，获得混合对照品母 液，用10-90%甲醇水溶液优选为60%甲醇水溶液对倍稀释后，即得混合对照品溶液。第 一混合母液中，芦丁的浓度为2000 μ g/mL、槲皮素的浓度为160 μ g/mL、山奈素的浓度为 100 μ g/mL。第二混合母液中，异鼠李素的浓度为30 μ g/mL。
[0108] I. 2色谱条件
[0109] 高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：C18柱；柱温：30-40°C ;检测波长： 230-280nm ;参比波长：400-500nm ;流速：0· 5-2. Oml/min ;进样量：5-20 μ 1 ;流动相：乙 腈-0. 1-0. 4v/v%磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0. 1-0. 4v/v%磷酸水溶液；分析时 间：70min ;梯度洗脱。
[0110] 高效液相色谱法的优选色谱条件为：色谱柱=Agilent Poroshell 120 SB C18柱 (150mmX4· 6mm，2. 7 μπι);柱温：3f5°C ;检测波长：254nm ;参比波长：450nm ;流速：lml/min ; 进样量：10 μ 1 ;流动相：乙腈-0. lv/v%磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0. lv/v%磷 酸水溶液；分析时间：70min ;梯度洗脱。
[0111] 梯度洗脱的具体程序为：
[0112] O-lOmin，A 相：B 相体积比为 12 :88-13 :87 ;
[0113] 10-13min，A 相：B 相体积比为 13 :87-15 :85 ;
[0114] 13-20min，A 相：B 相体积比为 15 :85-16 :84 ;
[0115] 20-30min，A 相：B 相体积比为 16 :84-21 :79 ;
[0116] 30-40min，A 相：B 相体积比为 21 :79-23 :77 ;
[0117] 40-50min，A 相：B 相体积比为 23 :77-30 :70 ;
[0118] 50-70min，A 相：B 相体积比为 30 :70-75 :25。
[0119] L 3指纹图谱的测定
[0120] 采用上述1. 2中色谱条件的高效液相色谱法分别测定上述I. 1中制备获得供试品 溶液和参照品溶液，获得的供试品溶液和参照品溶液的指纹谱图，与银杏酮酯的标准指纹 谱图进行比较，根据相对保留时间，指认出共有特征峰，从而获得供试品溶液中黄酮类和有 机酸类成分的指纹图谱。
[0121] 其中，供试品溶液和参照品溶液的指纹谱图与银杏酮酯的标准指纹谱图进行的比 较时，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价软件2. 0版》进行相似度 比较，以参照品溶液的指纹谱图中的芦丁色谱峰（S峰）为参比峰，根据相对保留时间，指认 出供试品溶液的指纹谱图中其它共有特征峰。
[0122] 中药色谱指纹图谱相似度评价软件的检测条件为：时间窗：0. 15 ;平均值法；多点 校正；全谱峰匹配。
[0123] 供试品溶液中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱中的黄酮类和有机酸类成分，采 用电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱法进行测定验证，通过相对保留时间，确定供试 品溶液的指纹谱图中黄酮类和有机酸类成分。测定获得的黄酮类和有机酸类成分共有45 种成分，具体成分见表1、图4。
[0124] 电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱法的检测条件为：离子源：ESI源；检测 模式：负离子电喷雾电离模式（ESI-);采集质量范围（Mass range) :50-1200Da;毛细管电 压（Capillary Voltage) :2.5kV;锥孔电压（Sampling Cone Voltage) :30V;离子源温度 (Soure Temperature) :12CTC ;去溶剂化温度（Desolvation Temperature) :50CTC ;去溶剂 化气体流量（Desolvation Gas Flow) :800L/hr ;维孔气体流量（Cone Gas Flow) :50L/hr ; 校正液：甲酸钠、亮氨酸脑啡肽（Leu_enkephaline，LE);碰撞气体：氩气；低碰撞能量通道： 5eV ;高碰撞能量通道：25-55eV能量梯度。
[0125] 1. 4黄酮类和有机酸类成分含量的测定
[0126] 采用上述1. 2中色谱条件的高效液相色谱分别测定上述I. 1中制备获得中的供试 品溶液和对照品溶液，其中，根据采用1. 1中制备的对照品溶液中黄酮类和/或有机酸类成 分，采用外标法计算供试品溶液中相应黄酮类和/或有机酸类成分的含量。
[0127] 2、检测条件的优化
[0128] 2. 1梯度洗脱程序的选择
[0129] 在采用高效液相色谱进行测定时，分别考察了 4种梯度洗脱程序，其具体程序见 表3,采用4种梯度洗脱程序进行测定后，获得的指纹图谱见图2。由图2可知，在兼顾色谱 峰分离度及分析时间情况下，第4种梯度洗脱程序最佳。
[0130] 表3梯度洗脱程序的比较
[0131]
[0132] 2· 2液相色谱条件中流动相的选择
[0133] 在采用高效液相色谱进行测定时，分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸、 乙腈-乙酸、乙腈-磷酸体系，发现各体系中，乙腈-磷酸体系峰型拖尾现象减弱，可见乙 腈-磷酸体系作为流动相最佳。同时，考察磷酸含量分别为〇. 1%、〇. 2%、0. 3%、0. 4%水溶 液，结果见图3。由图3可知，随磷酸含量增加图谱未有明显变化，考虑基线平稳度和峰型， 选择乙腈-0. 1%磷酸水作为流动相最为适宜。
[0134] 2. 3提取方法的选择
[0135] 在制备供试品溶液时，分别考察了涡旋提取、超声提取、振荡提取、冷浸提取、回流 提取。各种提取方法的提取条件考察指标均为：得分=〇. 2Χ色谱峰个数+0. 8Χ (芦丁、槲 皮素、山柰素、异鼠李素总含量）。经考察后发现，各种提取方法中，涡旋提取的提取效果最 充分。
[0136] 2. 4提取溶剂的选择
[0137] 在制备供试品溶液时，进行涡旋提取时采用的提取溶剂，分别考察了甲醇、乙醇、 水、