一种用于复方丹参滴丸的一测多评检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种药物检测方法，特别涉及一种用于复方丹参滴丸的一测多评检测 方法，所述方法包含6种酪酸类成分的UPLC-测多评含量测定方法。
【背景技术】
[0002] 由于植物化学成分的复杂性，多指标含量测定已经成为植物来源药物质量控制的 共识。目前，越来越多的国内外植物药标准将多指标含量测定收录其中。然而，在多指标含 量测定方法实施的过程中，对照品消耗量大，检测操作难度高，严重制约了该方法的推广应 用。
[0003] 为解决W上问题，人们积极寻找替代性方法。研究人员发现，不同物质在紫外检测 器中的响应-浓度比的比值是一个常数，并将该常数定义为相对校正因子。在样品检测过 程中，使用外标法测定A化合物的峰面积并获得其含量，同时测定B化合物的峰面积，便可 W根据W上信息和A/B物质间相对校正因子，计算获得B化合物的含量。该替代对照品法 被命名为一测多评法。
[0004] 由于大大减少了对照品的用量，并降低了检测试验的操作难度，一测多评质量控 制方法得到迅速的推广和应用。目前，美国药典约有20余个品种，欧洲药典约有10余个品 种，中国药典有1个品种（黄连），使用该方法对植物来源药物进行多指标含量测定，且数目 仍在不断增加。
[0005] 复方丹参滴丸为一种已经上市的活血化癒，理气止痛药物。用于气滞血癒所致的 胸瘦，症见胸闷、必前区刺痛；冠必病必绞痛见上述证候者。复方丹参滴丸是由丹参、Η走、 冰片3味中药组成，丹参作为君药，现有技术中并没有一测多评方法对其进行检测的报道。
[0006] 复方丹参滴丸有效成分复杂，将一测多评方法用于其中是否适合，W及如何进行 其中的有效成分分析成为一个问题，本发明人对此进行了研究，复方丹参滴丸含有多种酪 酸类成分，选择药理活性明确且含量比较丰富的6种酪酸类成分（分别为丹参素，原儿茶 醒，迷迭香酸，紫草酸，丹酪酸Β和丹酪酸Α)进行测定。在开发一测多评方法时，单个标定 物的选择将严重影响测定方法的可靠性和实用性。目前没有筛选单个标定物的科学方法。
[0007] 在一测多评多指标含量测定方法的过程中，由于分析物含量由相对校正因子计算 获得，故相对校正因子的稳定性会影响到最终的含量测定结果的准确性。本发明人对此进 行了研究，找到了一种对其中酪酸类化合物进行检测的方法，发现该类化合物特别适合用 一测多评方法，从而解决了相关的技术问题。
【发明内容】
[0008] 针对现有单一成分和多指标含量测定方法的不足，本发明提供一种高实用性、操 作简单、节约成本的针对复方丹参滴丸6种酪酸类成分的检测方法。
[0009] 本发明的检测方法，包括W下步骤：
[0010] 1)将复方丹参滴丸制备成测试液；
[0011] 2)用超高效液相色谱仪测定测试液中原儿茶醒含量；
[0012] 3)使用相对校正因子计算样品中丹参素、丹酪酸B、丹酪酸A、迷迭香酸和紫草酸 的含量。
[0013] 其中，1)将复方丹参滴丸制备成测试液；方法如下：取复方丹参滴丸20-30粒， 精密称定，于20-30血量瓶中，加入15-25血水，超声5-15min，待冷却至室温，定容至 20-30血，过0. 2-0. 3μm的滤膜，得到滤液即为待测试液。
[0014] 优选的，
[0015] 方法如下：取复方丹参滴丸25粒，精密称定，于25mL量瓶中，加入20mL二纯水，超 声（300W，50曲Z)lOmin，待冷却至室温，定容至25血，过0. 22μm滤膜，得到滤液即为待测试 液。
[0016] 其中，2)用超高效液相色谱仪测定测试液中原儿茶醒含量；方法如下：
[0017] 用超高效液相色谱仪分别测定待测样品溶液和对照品溶液中原儿茶醒的峰面积， 使用外标一点法或工作曲线法计算原儿茶醒含量；其中外标一点法使用浓度为40μg/mL 的原儿茶醒作为对照品，工作曲线法采用浓度范围在1〇-1〇〇μg/mL的至少五个梯度的原 儿茶醒作为对照品溶液
[0018] 仪器；选择最高耐受压力大于eOOOpsi或40化ar的高效液相色谱仪；
[0019] 色谱柱；选择亚2um填料尺寸的色谱柱，优选WatersAC卵口YUPLC色谱柱或 DikmaEndeavors! 1 色谱柱；
[0020] 流动相选用如下Η种方案中的一种：
[0021] 曰、溶剂A为醋酸盐缓冲溶液，其中含0. 3-0. 5%己酸及0. 05-0. 1%Η己胺-溶剂 Β己腊；
[0022] b、溶剂Α0. 1-0. 3%甲酸水溶液-溶剂Β己腊；
[0023] C、溶剂A0. 1-0. 3 %醋酸水溶液-溶剂B己腊；
[0024] 梯度洗脱程序选用如下洗脱方案中的一种：
[00巧]① 0 ~Imin, 8% - 12%B, 1 ~3min, 12% - 17%B, 3 ~6min, 17% - 20%B, 6 ~ 8min，20% -23%B，8 ~10min，23% -27%B;
[0026] ② 0 ~Imin, 5%-10%Β, 1 ~3min, 10% - 15%Β, 3 ~6min, 17% - 20%Β, 6 ~ 8min，20% -23%Β，8 ~10min，23% -27%Β;
[0027] ⑨ 0 ~Imin，10 % - 14 %B，1 ~3min，14 % - 20 %B，3 ~6min，20 % - 23 %Β, 6 ~8min，23% -27%B，8 ~10min，27% -30%B;
[0028] ④ 0 ~0. 5min, 8% - 12%B, 0. 5 ~2. 5min, 12% - 17%B, 2. 5 ~5.5min，17%-20%B，5. 5 ~7. 5min，20% -23%B，7. 5 ~9. 5min，23% -27%B;
[0029] ⑤0 ~3min，8% - 12%B，3 ~5min，12% - 17%B，5 ~8min，17% -20%B，8 ~ 10min，20% -23%B，10 ~12min，23% -27%B;
[0030] 流速；0. 36-0. 44mL/min；
[003。柱温：25-35°C
[0032] 进样量：1-5μL
[0033] PDA检测器波长：279-283皿，327-331皿；或可变波长检测器，波长程序；0~ 3min,281nm,3 ~8min,329nm,8 ~lOmin,281nm。
[0034] 步骤2优选的检测方法为：
[0035] 其中，步骤2)所述色谱条件设定如下：
[0036]色谱柱；AC卵口Y C18
[0037] Waters AC卵口Y 11?1〔哪邸C18预柱 [003引流动相；A相，0.2%甲酸水；B相，纯水；
[0039]梯度洗脱程序；0~Imin，8 % - 12 %B，1 ~3min，12 % - 17 %B，3 ~6min, 17% -20%B，6 ~8min，20% -23%B，8 ~10min，23% -27%B;
[0040]流速；0. 36-0. 44血/min;
[0041] 柱温：25-35°C [004引进样量；1-5μΙ
[0043]PDA检测器波长；281nm，329nm。
[0044] 步骤2最优选的检测方法为：
[0045]色谱柱；ACQUITYIPLC哪EHC181. 7μm, 2. 1mmi.d.XlOOmm,
[0046]WatersA饼)ΙΠΤΥC18 预柱 1. 7μmparticles, 2. 1mmi.d.X5mm;
[0047] 流动相；A相，0. 2 %甲酸水；B相，纯水；
[0048] 梯度洗脱程序；0 ~Imin，8 % - 12 %B，1 ~3min，12 % - 17 %B，3 ~6min, 17% -20%B，6 ~8min，20% -23%B，8 ~10min，23% -27%B;
[0049]流速；0.4mL/min;
[0050]柱温；30C
[0051] 进样量；3yL
[0052]PDA检测器波长；281nm，329nm。
[0053] 其中，步骤3)使用对保留时间和相对校正因子分别确定和计算样品中丹参素、丹 酪酸B、丹酪酸A、迷迭香酸和紫草酸的峰位置和含量；
[0054] 定性方式；原儿茶醒相对于丹参素、丹酪酸B、丹酪酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对 保留时间为 0.55-0. 67,3. 87-4. 73,4. 37-5. 35,3. 11-3. 80 和 3. 40-4. 163 ;
[0055] 待测物质保留时间的计算公式为；RL=RRTyXRTs
[0056] 其中，RL和RL分别代表待分析物和原儿茶醒的保留时间，RRL为相对保留时间。
[0057] 定量方式；原儿茶醒相对于丹参素、丹酪酸B、丹酪酸A、迷迭香酸和紫草酸的相对 校正因子分别为 5. 91-7. 23, 3. 29-4. 02,1. 36-1. 66,1. 36-1. 66 和 3. 10-3. 79 ;
[005引；待测分析物浓度的计算公式为：
[0059] 其中，4和Ag分别为待分析物和原儿茶醒的峰面积，。和。分别为待分析物和原 儿茶醒的浓度，RFy为待分析物和原儿茶醒的校正因子。
[0060] 相对校正因子和相对保留时间优选：
[0061] 定性；W原儿茶醒为单个标定物，丹参素、丹酪酸B、丹酪酸A、迷迭香酸和紫草酸 的相对校正因子分别为0. 61,4. 30,4. 86,3. 45和3. 78 ;
[0062] 定量；W原儿茶醒为单个标定物，丹参素、丹酪酸B、丹酪酸A、迷迭香酸和紫草酸 的相对保留时间分别为6. 57、3. 65、1. 51、1. 51和3. 44。
[0063]W下为本发明所用名词术语的解释：
[0064] -测多评；替代对照品含量测定方法的一种，即先使用外标法测定样品中一种分 析物的含量，再通过分析物的峰面积和相对校正因子，计算样品中其他分析物中的含量。
[0065]UPLC;超高效液相色谱仪
[0066] 单个标定物的筛选；采用层次分析法，从可靠性和实用性两个角度选择单个标定 物。可靠性因素包括校正因子的耐用性和稳健性，实用性因素包括对照品的易得性、样品中 含量的高低和化合物的化学稳定性。根据W上信息，分析不同单个标定物的优势与劣势，最 大程度减小单个标定物对方法应用带来的影响。由于原儿茶醒具有最佳的可靠性和实用 性，故选择原儿茶醒作为单个标定物。
[0067] 6种酪酸类成分的分析测试方法：
[0068] 定性方式；对于丹参素、丹酪酸B、丹酪酸A、迷迭香酸和紫草酸，可通过比较相对 于原儿茶醒对照品色谱峰的相对保留时间进行定性，其相对保留时间分别为0. 61,4. 30， 4. 86, 3. 45和3. 78,计算公式如下：
[0069] RRTx=RTx/RTS
[0070] 其中，RL和RTs分别代表待分析物和原儿茶醒的保留时间，RRT、为相对保留时间。
[0071] 定量方式；对于原儿茶醒，可采用标准曲线法或外标一点法进行定量，对于丹参 素。丹酪酸B、丹酪酸A、迷迭香酸和紫草酸，可采用相对校正因子计算含量，相对校正因子 分别为6. 57、3. 65、1. 51、1. 51和3. 44,计算公式如下：
[0072]
[0073] 其中，4和As分别为待分析物和原儿茶醒的峰面积，。和。分别为待分析物和原 儿茶醒的浓度，RFy为待分析物和原儿茶醒的校正因子。
[0074] 本发明的检测方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
[00巧]1.色谱条件考察
[0076] 1. 1.最大吸收波长的选择
[0077]标准溶液一分别取适量丹参素值SS)、原儿茶醒（PCA)、迷迭香酸（R0A)、紫草酸 (LA)、丹酪酸B(SAB)和丹酪酸A(SAA)对照品，精密称定，溶解于70%甲醇水溶液中，得到浓 度分别为 0. 52,0. 22,0. 50,0. 50,0. 54 和 0. 47mg/mL的标准溶液。全UV范围（200-400nm) 内扫描标准溶液，分别测定待测物质的λmax。紫外光谱显示，丹参素、原儿茶醒、丹酪酸B 和丹酪酸A在281nm处有最大吸收，迷迭香酸在329nm处有最大吸收，紫草酸在329nm处有 平缓肩峰，因此检测波长设定为281nm和329nm(图1)。
[0078]1. 2.色谱柱考察
[0079] 考察ACQUITYU化CBEHC18(2.IXlOOmm, 1. 7um),ACQUITYU化CHSS C18 (2. 1XlOOmm, 1. 7μm)和AC卵口ΥIPLC服SΤ3 (2. 1XlOOmm, 1. 7μm)Η种填料色谱柱 对样品分离的影响。结果表明，Η根色谱柱均能够对目标化合物获得良好分离，但考虑到分 离时间，最终选择AC卵口ΥUPLC邸ΗC18进行试验（图2和表1)。
[0080] 表1色谱柱的选择
[0081]
[0082] 1. 3.流动相考察
[0083] 1. 3. 1流动相体系考