裁成4cm*0. 6cm的规格后4°C密封保存备用，至此制得结合垫。
[0084] 二、样品垫的制备
[0085] 取玻璃纤维素膜一张，将其在样品垫处理液（2. 9g/L磷酸氢二钠，0. 295g/L磷酸 二氢钠，2g/L氯化钠，20g/L牛血清白蛋白（BSA)，10ml/L吐温-20，20g/L蔗糖，5g/L聚乙烯 吡咯烷酮（PVP-10)，pH 7. 3)中浸泡至少3h以上，再置于生物安全柜内37°C通风干燥后， 剪裁成4cm*2. 5cm的规格，25°C密封干燥保存。至此制得样品垫。经试验证实玻璃纤维素 膜经该种方法处理后，显著地提高了量子点标记抗体的释放率。
[0086] 三、检测层的制备
[0087] 检测层的制备，是通过分别将由步骤一中所制备的鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋 白多克隆抗体IgG和抗兔IgG用专用的喷膜机在硝酸纤维素膜上形成检测线和控制线；其 具体制备方法包括如下步骤：
[0088] 将步骤一中制备的鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体IgG和抗兔IgG用 磷酸盐缓冲液（2. 9g/L磷酸氢二钠，0. 295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠 ，pH 7. 3)分别均调 整至终浓度为〇. 5-2. 5mg/mL，其中鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体IgG优选的稀 释终浓度为I. 5-2. Omg/mL，抗兔IgG优选的稀释终浓度为0. 5-1. 5mg/mL。将稀释好的鼠抗 人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置0. 8-2. 5 μ 1/ cm，优选为1. 0-2. 0 μ 1/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线；将稀释好的抗兔IgG装 入BIODOT划膜仪喷头中，设置0. 8-2. 5 μ 1/cm，优选为1. 0-2. 0 μ Ι/cm的量喷于硝酸纤维素 膜上作为质控线，其与检测线间距为〇. 7cm。将喷好的硝酸纤维素膜37°C干燥2h，剪裁成 4cm*4cm的规格，4°C密封干燥保存。至此制得检测层。
[0089] 四、底板的加工
[0090] 将PVC材质的底板裁剪成4cm*7. 3cm的规格后备用。
[0091] 五、吸水垫的制备
[0092] 将吸水滤纸裁剪成4cm*3cm的规格，即制成吸水垫，备用。
[0093] 六、检测卡的组装
[0094] 组装工作于生物安全柜内操作，首先将步骤四所述的底板上的粘性保护膜揭掉， 将上文步骤三所述的检测层（即带有1条质控线和1条检测线的硝酸纤维素膜）粘贴到底 板的中部区域，并小心抹平膜面。其次，将上文步骤五所述的吸水垫组装到底板上，使其左 边与检测层有0. 2cm的重叠，同时将其右边缘与底板的右边缘对齐粘好并小心抹平。再将 上文步骤一所述的结合垫按0. 3cm重叠于硝酸纤维素膜的左边缘处，0. 3cm粘于底板上。最 后将上文步骤二所述的样品垫则按一边〇. 3cm重叠于结合垫的左边缘处，另一边与底板的 左边缘对齐，粘于底板上并小心抹平。将组装好的检测板于切条机下裁成4. Omm宽的检测 卡，4°C密封干燥避光保存。至此制得人肺炎衣原体量子点免疫层析检测卡。
[0095] 上述人肺炎衣原体量子点免疫层析检测卡的使用方法，步骤如下：
[0096] 将待检样品（如咽拭子等）用500 μ 1的样品处理液（2. 9g/L磷酸氢二钠，0· 295g/ L磷酸二氢钠 ，Nonidet P-4010ml/L，SDS lml/L，2g/L氯化钠，ρΗ7·3)充分溶解后，取出 120 μ L滴于检测卡的样品垫上，15分钟后于紫外灯下观察检测结果。若待检样品中含有人 肺炎衣原体抗原，则与结合垫中的量子点标记的抗人肺炎衣原体纳米探针结合，通过层析 作用先与硝酸纤维素膜上的鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体结合后在紫外线激 发下在检测线处会形成肉眼可见的一条荧光检测线，未结合完的量子点标记抗体继续层析 与抗兔IgG结合后在紫外线激发下形成肉眼可见的第二条荧光质控线；若待检样品中无相 关抗原，则仅出现一条荧光质控线。如果荧光质控线未出现，则该检测卡失效。
[0097] 本发明所需的羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS量子点可到例如武汉珈 源量子点技术开发有限公司等专业性公司购买；所需的PVC材质底板、吸水滤纸、硝酸纤维 素膜、聚酯纤维膜、玻璃纤维素膜等可到Millipore及上海金标生物科技有限公司等专业 性公司购买，所需的其他常规仪器、设备、生化药品均有市售。
[0098] 本发明通过以下实施例作进一步具体描述。
[0099] 本发明使用或采用的各种材料的来源及相关试剂的配制
[0100] 1、样品垫处理液：称取0. 29g磷酸氢二钠，0. 0295g磷酸二氢钠，0. 2g氯化钠，2g 牛血清白蛋白（BSA)，Iml吐温-20, 2g蔗糖，0.5g聚乙烯吡咯烷酮（PVP-10)，溶解于90ml 的去离子水中，用lmol/L NaOH调pH至7. 3后用去离子水定容至100ml。
[0101] 2、磷酸盐洗涤液：称取0. 29g磷酸氢二钠，0. 0295g磷酸二氢钠，0. 2g氯化钠， 0. 5ml吐温-20,0.1 g叠氮化钠，溶解于90ml的去离子水中，用Imol/LNaOH调pH至7. 3后 用去离子水定容至l〇〇ml。
[0102] 3、磷酸盐保存液：称取0· 29g磷酸氢二钠，0· 0295g磷酸二氢钠，0· 2g氯化钠 ，Ig 牛血清白蛋白（BSA)，0.1 g NaN3，溶解于90ml的去离子水中，用lmol/L NaOH调pH至7.3 后用去离子水定容至l〇〇ml。
[0103] 4、磷酸盐缓冲液（PBS):称取0. 29g磷酸氢二钠，0. 0295g磷酸二氢钠，0. 2g氯化 钠，溶解于90ml的去离子水中，用lmol/L NaOH调pH至7. 3后用去离子水定容至100ml。
[0104] 5、兔抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体IgG :为本发明自制，用PBS稀释，摇 匀，使溶液中多克隆抗体浓度为3mg/ml。
[0105] 6、鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体IgG :为本发明自制，用PBS稀释，摇 匀，使溶液中多克隆抗体浓度为3mg/ml。
[0106] 7、羊抗兔IgG :为博士德公司产品，用PBS稀释，摇匀，使溶液中多克隆抗体浓度为 lmg/ml〇
[0107] 8、量子点：本发明中所用量子点为羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS量 子点，其发射波长为565nm，购买自武汉珈源量子点技术开发有限公司，产品名称为羧基水 溶性量子点-565。
[0108] 9、玻璃纤维素膜：厚度为0. 4mm，吸水量为42mg/cm2,玻璃纤维直径为0. 6-3 μ m， 具有良好的亲水性，购买于上海金标生物科技有限公司（型号为BT40)。
[0109] 10、聚酯纤维膜：厚度为0. 48mm，吸水速度为18s/4cm，具有极好的亲水性，用于结 合垫的制备，购买于上海金标生物科技有限公司（型号为DL42)。
[0110] 11、硝酸纤维素膜：型号为Millipore Corp SHF135,有衬板，购买于Millipore公 司。
[0111] 12、吸水滤纸：厚度为0. 95mm，吸水速度为60s/4cm，吸水量为700mg/cm2,具有良 好的吸水性，作为制作吸水垫的材料。购买于上海金标生物科技有限公司（型号为CH37K)。
[0112] 13、底板：为高白度PVC材质，表面涂布单层高聚合物压敏胶SM31，购买于上海金 标生物科技有限公司。
[0113] 14、人肺炎衣原体菌株：购自美国典型培养物保藏中心（ATCC)，编号为 ATCC53592。
[0114] 15、本发明所用到的微生物样品均购自美国典型培养物保藏中心（ATCC)。
[0115] 下面结合实施例对本发明所提供的技术方案进行详细说明：
[0116] 实施例1 (制备实施例）
[0117] 结合垫的制备
[0118] (一）重组M98_His融合蛋白的制备、纯化
[0119] 1.相关基因的克隆
[0120] 对人肺炎衣原体98KD表面蛋白（其NCBI蛋白质数据库中的accession number 为CAA04672)进行生物信息学分析，获取其胞外保守结构域中抗原表位最为丰富的肽段， 找到其对应的DNA编码序列，同时在其5'引入酶切位点Ndel、3'端引入终止信号TAA和 酶切位点XhoI后化学合成全基因序列（全序列合成交由金斯瑞生物科技有限公司完成， 交货时人工合成的基因片段连于载体PUC57上），记为m98。其基因全序列如序列表所示。 具体的说，m98基因编码的蛋白质序列为天然人肺炎衣原体98KD表面蛋白（accession number:CAA04672)的130-305aa。将含有该段人工合成的DNA片段的载体pUC57用NdeI 及XhoI进行双酶切后按常规方法回收目的片段，备用。同时采用NdeI及XhoI对载体 pET-28a(+)进行双酶切，并按常规方法将经双酶切后获得的m98基因连入pET-28a(+)载体 中，并转化大肠杆菌T0P10,构建pET-M98表达载体。经酶切和序列测定证实表达载体构建 无误。该载体表达重组M98-Hi s融合蛋白。
[0121] 2.重组M98_His融合蛋白的表达与纯化
[0122] 将鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态 E. coliBL21 (DE3)中，转化完成后将菌液涂布于含50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，按常 规方法筛选表达菌株。挑取PET-M98转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并接种入 IOOmL LB培养基中，于37°C培养过夜。取出菌液后，按I :100接种于IOOmL含有50 μ g/mL 卡那霉素的LB培养基中，于37°C培养至0D6。。= 0. 6时，加入lmol/LIPTG至终浓度为lmmol/ L，于37°C摇菌培养，诱导融合蛋白表达。诱导4h后分别于8000r/min下离心10min收集 菌体。将菌体用20mL PBS缓冲液洗涤3次并再次重悬后进行超声破碎，操作条件为：50HZ， 200W，超声3S，间歇5S，工作100次。超声完成后，12000g离心15min收集沉淀，即为包涵 体。将此包涵体用洗涤缓冲液（20mM Na3P04,0. 5M NaCl ;3M尿素，30mM咪唑，pH7. 4)洗涤两 次后，12000g 离心 15min 收集沉淀。将沉淀用 Binding buffer (20mM Na3PO4,0.5M NaCl ;8M 尿素，30mM咪唑，pH7. 4)于室温下溶解后，12000g离心15min，上清用0. 45 μ m的滤膜进行 过滤。此溶解液中的重组蛋白用His Trap affinity columns(GE healthcare公司产品）， 按照说明书的方法进行纯化。具体方法如下：
[0123] 1)用5mL注射器吸满蒸馏水，拧开柱的塞子，用提供的接头将柱和注射器连接上， 以lmL/min流速洗柱。
[0124] 2)用 10mT, Binding buffer 平衡，lmL/min 流速。
[0125] 3)将融合蛋白上样，lmL/min流速。
[0126] 4)用 10mT, Binding buffer，以 lmL/min 流速洗柱。
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