测定结果的灵敏度和重现 性这一现象提出合理的解决方案：即通过在高效液相色谱仪的流动相中加入一定量的甲酸 铵或甲酸(液-质联用分析中常用的流动相添加试剂），采用ESI(-)或APCI(-)电离模式，使 待测化合物在电离后能够形成单一的加甲酸根准分子离子峰，继而在给予一定能量下被打 碎产生特征性的碎片离子，通过检测准分子离子峰-子离子的离子通道实现灵敏特异的二 级质谱检测。与ESI( + )电离模式的定量分析方法比较，紫杉烷类化合物在ESI(-)或APCI(-) 电离模式下均可形成单一的一级质谱准分子离子峰，具有特异、灵敏、稳定、重现性好等特 点。
[0024]因此，本发明提供了一种基于高效液相色谱-三重四级杆质谱联用技术测定多西 他赛或紫杉醇的方法，所述方法包括在高效液相色谱仪中使用包含甲酸铵或甲酸的流动相 的步骤，以及在ESI(-)或APCI(-)电离模式下采用MRM模式测定多西他赛或紫杉醇的加甲酸 根准分子离子峰和子离子峰的步骤。
[0025]优选地，所述流动相为:溶剂A:甲酸或甲酸铵的水溶液；
[0026]溶剂B:乙腈(ESI-)/甲醇(APCI-)。
[0027]优选地，本发明方法中，待测样品中的多西他赛或紫杉醇的浓度为2.00~4000ng/mL；
[0028]优选地，本发明方法中，在ESI(-)电离模式下，所述溶剂A中的甲酸铵或甲酸的浓 度为20~ΙΟΟΟμΜ，优选甲酸铵或甲酸的浓度为40~800μΜ;最优选甲酸铵或甲酸的浓度为约 100μΜ〇
[0029]以及，在APCI(-)电离模式下，所述溶剂Α中的甲酸铵或甲酸的浓度为500μΜ~ 50000μΜ，优选2000μΜ~50000μΜ，最优选5000μΜ。
[0030] 优选地，本发明方法中，检测多西他赛的m/z为852 - 206(ESI_)或852 - 280 (APCI-)离子对，及紫杉醇的m/z为898-525(ESI-/APCI_)离子对。
[0031]根据本发明的测定多西他赛或紫杉醇的方法，其包括如下步骤：
[0032] 1)制备待测样品；
[0033] 2)采用高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测样品进行分离和检测多 西他赛或紫杉醇，
[0034]所述高效液相色谱系统的条件为：
[0035]色谱柱：AgilentEclipseplusCis柱（2.1X50mmID，5ym);
[0036]柱温：35 ~45°C，优选 40°C;
[0037] 流动相：
[0038] 溶剂A:甲酸或甲酸铵的水溶液；
[0039]溶剂B:乙腈(ESI-)/甲醇(APCI-);
[0040]梯度洗脱条件:Omin以20 %溶剂B洗脱，0~0.50min溶剂B从20 %匀速增加至60 %， 0·51~0·80min溶剂B从60 %匀速增加至90 %，0·81~1·50min以90 %溶剂B洗脱，1·51~ 1.60min溶剂B从90%匀速下降至20%，1.61~3.50min以20%溶剂B进行柱平衡；
[0041]流速：0.40(ESI-)/0.80(APCI-)mL/min;
[0042]进样量：10yL;
[0043]质谱条件:采用ESI/APCI源负离子检测模式 [0044]在ESI(_)电离模式下：
[0045]电离模式:ESI(_)电离模式；
[0046]检测模式:MRM模式；
[0047]喷雾电压：-4000 ~-5000V，优选-4500V;
[0048]雾化温度:400 ~600°C，优选550°C;
[0049] 去簇电压：-30~-50V，优选-42V;
[0050] 碰撞能量：多西他赛，-45~-55V，优选-51V;紫杉醇，-20~-30V，优选-24V;
[0051 ] 雾化气压力：40~60psi，优选50psi;
[0052] 辅助气压力：50~65psi，优选60psi;
[0053]气帘气：20 ~40psi，优选 30psi;
[0054] 或者在APCI(-)电离模式下：
[0055]电离模式:APCI(-)电离模式；
[0056]检测模式:MRM模式；
[0057]喷雾电压：-4500 ~-5500V，优选-5000V;
[0058]雾化温度：350 ~450°C，优选400°C;
[0059]去簇电压：多西他赛，-42~-52V，优选-47V;紫杉醇，-38~-48V，优选-43V;
[0060] 碰撞能量：多西他赛，-30~-40V，优选-35V;紫杉醇，-22~-32V，优选-27V;
[0061] 雾化气压力：40~70psi，优选60psi;
[0062]气帘气：15 ~25psi，优选 20psi。
[0063]所述检测方法为串联质谱检测，具体为:采用ESI/APCI源负离子检测模式，优化仪 器喷雾电压（Ionsprayvoltage)、雾化气（Iongas1)、辅助气体（Iongas2)、去簇电压 (Declusteringpotential)、碰撞能量(Collisionenergy)等质谱工作参数得到多西他赛 或紫杉醇的最佳离子化响应。优选地，在MRM模式下，检测多西他赛的m/z为852-206(ESI_) 或852-280(APCI-)离子对，及紫杉醇的898-525离子对。
[0064]更优选地，在ESI(-)电离模式下多西他赛和紫杉醇分析的质谱工作参数如下表1 所示：
[0065]表1:ESI(_)电离模式下多西他赛和紫杉醇分析的质谱工作参数[0066]
[0067]以及，在APCI(-)电离模式下多西他赛分析的质谱工作参数如下表2所示：
[0068]表2:在APCI(-)电离模式下多西他赛分析的质谱工作参数：
[0069]
[0070]本领域技术人员可以理解，对于多西他赛和紫杉醇含量的测定，可以采用不同条 件下的分离或检测方法进行，只要这些方法适合多西他赛和紫杉醇。
[0071]当然，为了方便，优选使用相同条件下的分离或检测方法，这样可以达到快速测定 的目的。
[0072]进一步优选地，所述待测样品是由人或动物的生物样品经过预处理得到的，优选 地，所述预处理包括如下步骤：
[0073] 1)向人或动物的生物样品100yL中加入叔丁基甲醚lmL，经振摇3min和14000rpm离 心5min后取上清液，用35°C氮气吹干，用甲醇-H2〇溶液(75:25，v/v) 100yL复溶，14000rpm离 心5min后得到作为待测样品的上清液。
[0074]本领域技术人员可以理解，除非另有具体说明，在本发明申请文件中所列举的数 值都是大约的数值，所述相同为大体上相同，两者都可以具有误差，所述误差例如可以为〇 至± 10%，优选0至±5%。
【附图说明】
[0075]图1不同电离模式下多西他赛(A)和紫杉醇(B)的质谱离子化形式。
[0076]图2多西他赛(A)及紫杉醇(B)在负离子电离模式下的二级质谱图。
[0077]图3显示ESI(-)模式下液相流动相中甲酸铵浓度与质谱响应的关系，（A)多西他 赛;（B)紫杉醇。
[0078]图4显示APCI(-)模式下液相流动相中甲酸铵浓度与质谱响应的关系，（A)多西他 赛;（B)紫杉醇。
[0079]图5为多西他赛胶束给药后大鼠全血中多西他赛的药-时曲线图。
【具体实施方式】
[0080]液-质联用系统:液相-质谱联用分析系统(LC-MS/MS)由日本岛津prominenceLC-20系列高效液相色谱系统以及ABSciex公司生产的API3200Qtrap线性离子阱-串联四级杆 杂交质谱分析仪组成，系统工作软件为Analyst1.5。
[0081]HPLC级甲醇(CH30H)、乙腈(CH3CN)，叔丁基甲醚(CsH^O)为美国Merck公司生产的试 剂；甲酸（HC00H)、乙酸（CH3⑶0H)和乙酸铵（CH3C00NH4)为美国Tedia公司生产；甲酸铵 (HC00NH4)为德国CNW公司生产。实验用水由PallCascada纯水仪制备。其它有机试剂由中 国医药(集团）上海化学试剂公司提供，分析纯。
[0082]实施例1不同电离模式下多西他赛和紫杉醇的质谱离子化形式[0083]实验方法：
[0084] 1、紫杉醇或多西他赛对照品溶液浓度:50yg/mL，以针栗推注的方式通过T型三通 与液相流动相混合后进入质谱检测器。
[0085] 2、液相流动相:溶剂A:水溶液;溶剂B:乙腈。溶剂A中的电解质及浓度分别为：（1) 1 %〇甲酸；（2) 1 %。乙酸；（3) 1 OmM甲酸铵；（4) 1 OmM乙酸铵。
[0086]3、液-质联用分析条件:色谱柱:AgilentEclipseplusCi8柱（2.1X50mm，5ym);柱温:40°C;洗脱条件：以46.5 %溶剂B等梯度洗脱;流速:0.40mL/min;质谱检测采用ESI( + ) 或ESI(-)电离模式。
[0087] 4、针栗速度：10yL/min。
[0088] 5、结果表示:采集20个扫描时间点的累积质谱响应值(MCA)，计算质谱响应（％ )，计算方法如下：
[0089] 质谱响应（％ )=(单个离子峰响应/所有离子峰响应的总和）X100%
[0090]结果:采用ESI( + )电离模式进行一级质谱检测时，紫杉醇和多西他赛在所添加的 四种电解质条件下，均有多个碱金属加合离子的产生。质谱图中可见[M+H] +、[M+Na] +、[M+K ]+或[M+NH4]+峰(参见图1)，其中[M+H]+和[M+Na]+峰的响应相对较强。仅在流动相中添加乙 酸时(DP值为70V)可观察到较为单一、集中的紫杉醇[M+H]+峰(质谱响应约占所有离子峰响 应总和的90%)。实验还发现，质谱参数中的去簇电压(DP)值对紫杉烷类化合物加合离子的 形成有一定的影响。低DP值有利于其[M+H]+峰的形成(70V为最佳条件），而高DP值有利于其 [M+Na]+峰的形成（200V为最佳条件）。此外，多西他赛或紫杉醇的[M+NH4]+峰较易在低DP值 下形成，而加大DP值后(200V)均未观察到[M+NH4]+峰。
[0091]采用ESI(-)电离模式进行一级质谱检测时，当液相流动相中含有甲酸或甲酸铵 时，紫杉醇和多西他赛的[Μ-ΗΓ峰信号非常弱，仅在质谱图上观察到很强的[M+HCO0r峰信 号；而当液相流动相中含有乙酸或乙酸铵时，紫杉醇和多西他赛除可在所采集的质谱图中 见[M+CH3CO0r峰外，另有[Μ-ΗΓ及[M+HCO0r峰的产生（图1)。
[0092]结论:ESI( + )电离模式下进行一级质谱检测时，紫杉醇和多西他赛可产生多样的 离子化形式，不利于质谱检测。而当采用ESI(-)电离模式时，多西他赛和紫杉醇虽不易形成 [Μ-ΗΓ峰，但均可产生较强的、唯一的[M+HCO0r峰，比ESI( + )电离模式更适合于液-质联用 检测。且[M+HCO0r峰