比[Μ-ΗΓ峰具有更高的特异性。目前为止，文献中未见采用ESI(-)或 APCI(-)电离模式对紫衫烷类化合物进行定量分析的方法，这可能与该类化合物在负离子 检测模式下不易形成去质子化的[Μ-ΗΓ峰有关。本发明采用的[M+HCO0r峰可大大提高紫杉 烷类化合物在负离子检测模式下的质谱响应，同时又避免了正离子检测模式造成的多种离 子化形式及环境中钠离子对质谱检测的影响等，大大提高了定量分析的准确性和特异性。 [0093]实施例2ESI(-)电离模式下，液相流动相中甲酸铵浓度的优化
[0094]实验方法：
[0095] 1、液-质联用分析条件:色谱柱:AgilentEclipseplusCi8柱（2.1X50mm，5ym); 柱温:40°C。液相流动相:溶剂A:H20或甲酸铵水溶液;溶剂B:乙腈。洗脱条件：以46.5 %溶剂 B等梯度洗脱。流速:0.40mL/min。进样量：10yL。质谱检测采用ESI(-)电离模式，在MRM检测 模式-51V的碰撞能量下，检测多西他赛的m/z852-206离子对;在-24V的碰撞能量下，检测 紫杉醇的m/z898-525离子对，质谱工作参数见表3，多西他赛和紫杉醇在ESI(-)电离模式 下的二级质谱图见图2。
[0096]表3:ESI(_)电离模式下定量分析多西他赛和紫杉醇的质谱工作参数
[0097]
[0098] 2、流动相中甲酸铵的浓度
[0099]流动相溶剂A中甲酸铵的浓度分别为0，10，20，50，100，200，500和ΙΟΟΟμΜ。
[0100] 结果:在流动相中未添加甲酸铵时，对多西他赛和紫杉醇均未检测到相应的质谱 信号。随着流动相中添加的甲酸铵的浓度的升高，化合物的质谱响应也不断升高，当甲酸铵 的添加浓度为1〇〇μΜ时，质谱响应达到最高。随着甲酸铵浓度的继续升高，化合物的响应出 现下降趋势（图3)。
[0101] 结论:本实验中添加的甲酸铵为液-质联用检测中常用的流动相电解质，方法简 单、易行，且酸碱度适中、挥发性好，不会造成色谱柱的劣化和质谱仪的污染。实验中观察到 流动相中甲酸铵的浓度与紫杉烷类化合物的质谱响应有关。通过进一步对流动相中添加的 甲酸铵浓度进行优化，结果表明：当采用ESI(-)电离模式进行多西他赛或紫杉醇的定量分 析时，甲酸铵的浓度优选为20~1000μΜ，进一步优选为40~800μΜ;最优选为100μΜ。
[0102]实施例3APCI(-)电离模式下，液相流动相中甲酸铵浓度的优化 [0103]实验方法：
[0104]1、液-质联用分析条件：色谱柱：AgilentEclipseplusCis柱（2.1X50mmID，5y m);柱温:45°C;流动相:溶剂A:H20或甲酸铵水溶液;溶剂B:甲醇。梯度洗脱条件:0~0.lmin 以20 %溶剂B洗脱，0.1~0.5min溶剂B从20 %匀速增加至60 %，0.51~0.8min溶剂B从60 % 匀速增加至90%，0.81~1.511^11以90%溶剂8洗脱，1.51~1.61^11溶剂8从90%匀速下降至 20 %，1.61~3.5min以20 %溶剂B进行柱平衡;流速:0.80mL/min;进样量：10yL。质谱检测采 用APCI(-)离子源，在MRM检测模式-35V的碰撞能量下，检测多西他赛的m/z853-280离子 对;在-27V的碰撞能量下，检测紫杉醇的m/z898-525离子对，质谱工作参数见表4。
[0105]表4:APCI(-)电离模式下多西他赛定量分析的质谱工作参数
[0106]
[0107] 2、流动相中甲酸铵的浓度
[0108] 流动相溶剂A中甲酸铵的浓度分别为0，500，2000，5000，10000，20000和50000μΜ。
[0109] 结果:在流动相中未添加甲酸铵时，均未检测到相应的质谱信号。随着流动相中添 加的甲酸铵浓度的升高，化合物的质谱响应也不断升高，在甲酸铵浓度达到5000μΜ及以上 时，多西他赛和紫杉醇的质谱响应升高趋缓(图4)。
[0110]结论:紫杉烷类化合物在APCI(-)电离模式下形成[M+HCO0r加合离子同样也需要 在液相流动相中添加一定量的电解质。经过实验优化，同时为避免过高的电解质浓度造成 对质谱离子源的污染，由图4可以看出，甲酸铵的浓度优选为500μΜ~50000μΜ，进一步优选 为 2000μΜ~50000μΜ，最优选5000μΜ。
[0111] 实施例4大鼠全血中多西他赛定量分析方法的建立
[0112] 以多西他赛为待测化合物，以紫杉醇为内标，建立大鼠全血中多西他赛定量分析 方法，并应用于静脉或灌胃给药多西他赛制剂后大鼠全血中的多西他赛浓度定量分析。
[0113] 1、液-质联用分析条件:溶剂Α:浓度为5000μΜ的甲酸铵水溶液;溶剂Β:甲醇;其余 条件同实施例3。
[0114] 2、大鼠全血样品前处理:将-70°C冷冻保存的大鼠全血样品（1ΟΟμυ室温解冻，分 别加入10yL紫杉醇（内标）溶液(浓度为500ng/mL)，涡旋混合后加入lmL叔丁基甲醚，振摇 2111；[11，离心（12000印111，10111；[11)后取上清液，氮气吹干后以50%乙腈溶液复溶（10(^1^)，离心 (12000rpm，5min)后取上清液用于液-质联用分析。
[0115] 3、结果:采用内标法建立了定量分析大鼠全血样品中多西他赛的液-质联用方法。 多西他赛在2.00~4000ng/mL的浓度范围内线性良好，相关系数(r)为0.998,定量下限为 2.00ng/mL。分析批质控样品中多西他赛浓度的准确度和精密度结果(表5)表明分析的准确 度和精密度能够满足生物样品定量分析所需的要求。大鼠静脉和灌胃给药多西他赛制剂后 不同时间点全血中多西他赛浓度结果见图5。
[0116]表5:测定小鼠全血样品中多西他赛浓度的准确度和精密度(η=10)
[0117]
[0118] 4、结论:采用APCI(-)离子源，多西他赛和紫杉醇的离子化形式与ESI(-)电离模式 下的结果一致，也可以产生唯一的[M+HC00]_峰。APCI(-)为气态的离子化过程，较ESI(-)电 离模式具有更强的抗基质效应的能力，可显著缩短样品分析时间，大大提高样品分析的通 量性。
【主权项】
1. 一种基于高效液相色谱-三重四级杆质谱联用技术测定多西他赛或紫杉醇的方法， 所述方法包括在高效液相色谱仪中使用包含甲酸铵或甲酸的流动相的步骤，以及在ESI(-) 或APCI(-)电离模式下采用MRM模式测定多西他赛或紫杉醇的加甲酸根准分子离子峰和子 离子峰的步骤。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，待测样品中的多西他赛或紫杉醇的浓度为2.00~ 4000ng/mL〇3. 根据权利要求1所述的方法，其中， 所述流动相为:溶剂A:甲酸或甲酸铵的水溶液； 溶剂B:乙腈(ESI-)/甲醇(APCI-)。4. 根据权利要求3所述的方法，其中，在ESI(-)电离模式下，所述甲酸或甲酸铵的水溶 液的浓度为20~ΙΟΟΟμΜ; 以及，在APCI(-)电离模式下，所述甲酸或甲酸铵的水溶液浓度为500~50000μΜ。5. 根据权利要求3所述的方法，其中，在ESI(-)电离模式下，所述甲酸或甲酸铵的水溶 液的浓度为40~800μΜ; 以及，在APCI(-)电离模式下，所述甲酸或甲酸铵的水溶液浓度为2000~50000μΜ。6. 根据权利要求3所述的方法，其中，在ESI(-)电离模式下，所述甲酸或甲酸铵的水溶 液的浓度为?〇〇μΜ; 以及，在APCI(-)电离模式下，所述甲酸或甲酸铵的水溶液的浓度为5000μΜ。7. 根据权利要求1所述的方法，其中，检测多西他赛的m/z为852-206(ESI_)或852- 280(APCI_)离子对，及紫杉醇的m/z为898-525(ESI-/APCI_)离子对。8. 根据权利要求1所述的方法，包括如下步骤： 1) 制备待测样品； 2) 采用高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测样品进行分离和检测多西他 赛或紫杉醇。9. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述高效液相色谱系统的条件为： 色谱柱:AgilentEclipseplusCis柱（2.1X50mmID,5ym); 柱温:35~45°C; 流动相： 溶剂A:甲酸或甲酸铵的水溶液； 溶剂B:乙腈(ESI-)/甲醇(APCI-); 梯度洗脱条件:〇min以20 %溶剂B洗脱，0~0.50min溶剂B从20 %匀速增加至60 %，0.51 ~0 · 80min溶剂B从60%匀速增加至90 %，0 · 81~1 · 50min以90%溶剂B洗脱，1 · 51~1 · 60min 溶剂B从90%匀速下降至20%，1.61~3.50min以20%溶剂B进行柱平衡； 流速：0.40(ESI-)/0.80(APCI-)mL/min; 进样量：10此； 质谱条件:采用ESI/APCI源负离子检测模式； 当在ESI(-)电离模式下时： 电离模式:ESI(-)电离模式； 检测模式:MRM模式； 喷雾电压：-4000~-5000V; 雾化温度:400~600°C; 去簇电压：-30~-50V，优选-42V; 碰撞能量：多西他赛，-45~-55V;紫杉醇，-20~-30V; 雾化气压力：40~60psi; 辅助气压力：5〇~65psi; 气帘气：20~40psi; 以及在APCI(-)电离模式下时： 电离模式:APCI(-)电离模式； 检测模式:MRM模式； 喷雾电压：-4500~-5500V; 雾化温度:350~450°C; 去簇电压：多西他赛，-42~-52V;紫杉醇，-38~-48V; 碰撞能量：多西他赛，-30~-40V;紫杉醇，-22~-32V; 雾化气压力：40~7〇psi; 气帘气：15~25psi。10.根据权利要求1所述的方法，其中， 所述柱温为40°C; 当在ESI(-)电离模式下时： 喷雾电压：-4500V; 雾化温度:550°C; 去簇电压：-42V; 碰撞能量：多西他赛，-5IV;紫杉醇，-24V; 雾化气压力:50psi; 辅助气压力:60psi; 气帘气:30psi; 以及在APCI(-)电离模式下时： 喷雾电压：-5000V; 雾化温度:400°C; 去簇电压：多西他赛，-47V;紫杉醇，-43V; 碰撞能量：多西他赛，-35V;紫杉醇，-27V; 雾化气压力:60psi; 气帘气:20psi。
【专利摘要】本发明涉及一种测定多西他赛或紫杉醇的方法。更具体而言，涉及一种基于高效液相色谱-三重四级杆质谱联用技术定量分析多西他赛或紫杉醇的方法，其中，所述方法包括在高效液相色谱仪中使用包含甲酸铵或甲酸的流动相的步骤，以及在ESI(-)或APCI(-)电离模式下采用MRM模式测定多西他赛或紫杉醇的加甲酸根准分子离子峰和子离子峰的步骤。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105424843
【申请号】CN201610005307
【发明人】孙艳, 王漪璇, 毋丹, 钱隽, 欧阳年
【申请人】复旦大学附属肿瘤医院
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2016年1月5日