基于细胞与微电极的相互作用实现单一癌细胞的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于癌细胞检测技术领域，特别涉及一种通过电化学方法研究细胞与微电 极的碰撞行为，实现单一细胞的检测方法，进而实现癌症的早期诊断。
【背景技术】
[0002] 细胞电化学是基于电化学原理、实验方法与细胞、分子生物学技术相互结合，对细 胞进行分析和表征，研究或模拟研究细胞荷电离子或电活性粒子能量传递的运动规律，揭 示细胞结构-功能关系和外源分子对细胞功能影响的一个新研究领域。目前电化学检测癌 细胞，是将玻碳电极上镀一层纳米金，然后修饰DNA，再将细胞特异性的结合，根据电极修饰 前后，电解池中K 4Fe (CN) 6/K3Fe (CN)6的电流信号的变化来检测细胞的。电极表面上修饰的 DNA是大量的，那么结合的细胞也是很多的，该方法通常不能实现对单个细胞的检测。
【发明内容】
[0003] 为了克服现有技术中的癌细胞检测技术所存在的不足，本发明提供了一种选择性 好、灵敏度高以及实现单一癌细胞的检测与识别的，基于细胞与微电极的相互作用实现单 一癌细胞的检测方法。
[0004] 本发明实现上述目的所采用的技术方案由以下步骤组成：
[0005] (1)将电化学活性分子或掺杂电化学活性分子的纳米粒子与能够特定识别癌细胞 的适配体DNA通过共价键结合；
[0006] (2)将待检细胞离心后，与步骤(1)的结合电化学活性分子的适配体DNA在4°C培养 2h后，离心，洗涤，分散在浓度为0.0 lmo 1 /L、pH=7.4的磷酸缓冲液中备用，使标有电化学活 性分子的适配体DNA与细胞表面蛋白特异性的识别；
[0007] (3)利用电化学工作站中的三电极体系进行电化学检测，以金微电极为工作电极、 铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极、0.01 mo 1/L pH=7.4的磷酸缓冲液为电解液，将 步骤(2)处理后的待检细胞注射到电解液中，待检细胞在电解池中自由运动，单一的待检细 胞与微电极表面发生碰撞，并粘附在其表面上时，待检细胞上的电化学活性物质能够发生 氧化反应，则产生电化学信号，即可确定该单一的待检细胞为癌细胞;若无电化学信号产 生，则说明该细胞非癌细胞。
[0008] 上述电化学活性分子是二茂铁小分子、亚甲基蓝或联钌吡啶等。
[0009] 上述适配体DNA是AS1411或Sgc8c，其中AS1411的序列为NH2-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG，Sgc8c的序列为NH2-ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA。
[0010] 上述纳米粒子是单质金属纳米粒子或无机化合物纳米粒子或复合纳米粒子，所述 金属纳米粒子是金、钼、镍或银纳米粒子，所述复合纳米粒子是金/钼复合纳米粒子或金/二 氧化娃复合纳米粒子，所述无机化合物纳米粒子为二氧化娃纳米粒子或碳量子点纳米粒子 或者复勒稀C60纳米粒子。
[0011] 本发明所提供的基于细胞与微电极的相互作用实现单一癌细胞的检测方法是利 用电化学活性分子通过癌细胞的特定适配体与癌细胞结合，使标有电化学活性分子的适配 体DNA与细胞表面蛋白特异性的识别，再利用电化学方法进行检测，当电解质中的癌细胞与 微电极发生碰撞时会产生电化学信号，由于微电极的有效面积很小，当细胞与电极发生碰 撞，并粘附在电极表面上，通过研究细胞与微电极的相互作用，实现单一细胞的研究及单一 癌细胞的识别，本发明的方法操作简单、灵敏度高、选择性好，可致力于癌症的早期诊断。
【附图说明】
[0012] 图1是二茂铁连接的细胞与微电极的碰撞的电流-时间关系曲线，直线表示无细胞 电流-时间关系曲线，曲线表示有细胞的电流-时间关系曲线。
[0013] 图2是氨基化的掺杂联钌吡啶的二氧化硅的纳米粒子TEM图。
[0014] 图3是修饰有掺杂联钌吡啶的二氧化硅纳米粒子连接的细胞在恒电位下（电位为 1.1V)与微电极碰撞的电流-时间关系曲线。
【具体实施方式】
[0015] 现结合实施例和实验、附图对本发明的技术方案进行进一步说明，但是本发明不 仅限于下述的实施情形。
[0016] 实施例1
[0017]本实施例的电化学活性分子选择二茂铁小分子，特定识别癌细胞的适配体DNA选 择AS 1411 (NH2-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG)，检测单一癌细胞的方法由下述步骤组成： [0018] (1 )将二茂铁小分子与能够特定识别Hela细胞的适配体AS1411( (NH2- GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG)通过共价键结合，具体是：
[0019] (1.1)活化羧基化的二茂铁小分子
[0020] 取纯化的二茂铁甲酸(Fc-C00H)102.5mg溶解在7mL二氯甲烷(简称DCM)中，加入质 量比为5:2的EDC(N'_(乙基羰基亚氨基)-N，N-二甲基丙烷_1，3二氨基氯化物)/NHS(N-羟基 丁二酰亚胺）中，在室温下，混合物在氮气氛围中持续搅拌17小时，反应完全后，混合物用水 洗3次，每次用水量为8mL，水相用15mL的DCM提取，有机相被MgS〇4干燥，混合物过滤，蒸发， 生成中间产物Fc-NHS，使其易于和氨基化的DNA结合。
[0021] (1.2)活化后的二茂铁与特定识别Hela细胞的适配体AS1411通过共价键结合。
[0022] 取中间产物溶解在50yL浓度为0.5111〇1/1、？!1=8.5的碳酸氢钠溶液，加入1(^的二 甲基甲酰胺，再加入l〇yL 200ymol/L的适配体AS1411，在4°C避光条件下，持续搅拌4h以使 反应完全，将生成物溶解在浓度为0.01mol/L、pH=7.4的磷酸缓冲液中，以备使用。
[0023] (2)将待检细胞用常规方法离心后加入步骤（1.2)的磷酸缓冲液中，使待检细胞与 结合电化学活性分子的适配体DNA在4°C培养2h，常规离心、洗涤后，分散在浓度为0.0 lmol/ L、pH = 7.4的磷酸缓冲液中备用，由于DNA能与细胞表面蛋白特异性的结合，所以电化学物 质二茂铁能有效标记在细胞表面。
[0024] (3)利用电化学工作站中的三电极体系进行电化学检测，以金微电极为工作电极、 铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极、0.01 mo 1/L pH=7.4的磷酸缓冲液为电解液，将 步骤(2)处理后的待检细胞注射到电解液中，在恒电位(电位为1. IV)下，标记有二茂铁分子 的待检细胞在电解液中自由移动，由于微电极的尺寸小，同时细胞之间存在电荷排斥和空 间位阻，就容易实现单一细胞与微电极表面发生碰撞，当单一的待检细胞与微电极表面发 生碰撞，并粘附在其表面上时，待检细胞上的二茂铁小分子能够发生氧化反应，瞬间产生增 大明显的电流信号，如图1所示，即产生电化学信号，可确定该单一的待检细胞为Hela细胞； 若无电化学信号产生，则说明该细胞并非是Hela细胞。
[0025] 实施例2
[0026] 本实施例的电化学活性分子选择联钌吡啶，纳米粒子是选用二氧化硅纳米粒子， 特定识别癌细胞的适配体DNA选择AS 1411 (NH2-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG)，检测单一 癌细胞的方法由下述步骤组成：
[0027] (1)将掺杂联钌吡啶的二氧化硅纳米粒子与能够特定识别Hela细胞的适配体 AS1411 ((NH2-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG)通过共价键结合，具体是：
[0028] (1.1)在掺杂联钌吡啶的二氧化硅纳米粒子(RuSNPs)表面官能团化
[0029]用反相微乳液的方法合成掺杂联钌吡啶的二氧化硅纳米粒子(RuSNPs)，其具体过 程如下：其中Triton X-100作表面活性剂，正己醇作助表面活性剂，环己烷作连续相，超纯 水作分散性，形成W/0型的微乳液，在室温25°C下，分别取1.8mL的Triton X-100、l .8mL的正 己醇、7.5mL的环己烷混合均匀，磁力搅拌30min后，加入超纯水后，溶液保持澄清透明，再加 入50-10(^]^的联舒[1比啶(1?11(^口7)3 2+)，联舒[1比啶(1?11(^口7)32+)能分散在水环境中，形成稳定 的油包水结构，继续搅拌lh后，加入正硅酸乙酯、氨水，持续搅拌24h后，再加入正硅酸乙酯 和3-氨丙基三乙氧基硅烷，再搅拌24h，待反应完全后，加入丙酮破乳，离心收集，分别用乙 醇，超纯水反复洗涤2或3次，在真空中至少放置两天，