烘焙食品中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的检测方法及应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种烘焙食品中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的检测方法及应用。
【背景技术】
[0002] 甲基咪唑是一种含氮杂环化合物，含一个甲基的甲基咪唑有1-甲基咪唑（1-MEI)、 2-甲基咪唑（2-MEI)和4-甲基咪唑(4-MEI)三种同分异构体，其中2-MEI和4-MEI具有强烈的 致惊厥作用，美国国家毒理学计划(NTP)通过动物毒理学实验证明2-MEI和4-MEI具有致癌 性，国际癌症机构（IARC)将其列为2B组"人类可能的致癌物"。美国加利福尼亚州环境健康 风险评估办公室(0ΕΗΗΑ)建议4-甲基咪唑的人体日摄入量应小于29 yg。氨法及亚硫酸铵法 生产的焦糖色素是2-MEI和4-MEI的主要来源。中华人民共和国国家标准GB8817-2001规定 了《食品添加剂焦糖色素》中4-MEI的含量不得超过0.02%。此外，2-MEI和4-MEI也存在于未 添加焦糖色素的食品中，但目前还未发现食品中存在另一同分异构体1-MEI。
[0003] 烘焙食品主要包括面包、饼干、糕点等几大类，随着生活节奏加快，烘焙食品的需 求量不断增加，已成为人们生活中不可或缺的食品。烘焙食品中的甲基咪唑来源于两条途 径：（1)添加的焦糖色素；（2)热加工过程中发生的美拉德反应。在世界范围内，曲奇饼干的 消费量持续攀升，曲奇高糖高脂的配方及高温焙烤的加工方式十分有利于美拉德反应伴生 危害物的形成，已报道的危害物有丙烯酰胺、晚期蛋白糖基化终末产物等，但尚未见到有关 曲奇中甲基咪唑的研究报告。本发明提供了一种烘焙食品中2-MEI和4-MEI的检测方法及应 用，以期为烘焙食品中美拉德反应伴生危害物一一甲基咪唑的检测及其水平控制提供技术 支撑。
[0004] 目前用于检测食品中甲基咪唑的方法有薄层色谱法、分光光度法、气/液相色谱法 (GC/LC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、二维色谱法、酶联免疫法、高效液相色谱串联质谱 法(LC-MS/MS)、超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)等。总体上看，薄层色谱法的操作 步骤多且定量不准确;分光光度法受基质干扰严重，测定结果偏差大;GC和GC-MS法的样品 前处理较为繁琐，且需要衍生化;ELISA法容易受到杂质的干扰，易产生假阳性;LC-MS/MS及 UPLC-MS/MS法，样品的前处理方法主要有QuEChERS试剂盒、离子对萃取、固相萃取、超临界 流体萃取、阳离子交换吸附等，采用这些净化方法虽然可以减少干扰，提高灵敏度，但却增 大了检测工作量和测试成本，并且目前方法都未考虑到同分异构体1-MEI可能对检测的干 扰。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种烘焙食品中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的检测方法及 应用。本发明的目的是通过如下技术方案来实现的： 烘焙食品中2-甲基咪唑(2-MEI)和4-甲基咪唑(4-MEI)的检测方法，其包括如下步骤： 1)在样品加入三氯乙酸和甲醇混合溶液以沉淀蛋白质及胶质等杂质，超声提取，定容， 提取液经离心、过滤得到待测溶液； 2)将步骤1)得到的待测液用CAPCELL CR(1:4)色谱柱(5 μπι，2.0 mmX150 mm)分离，采 用同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法对烘焙食品中2-MEI和4-MEI成分进行定性和定 量分析。
[0006] 所述步骤1)具体为:称取研磨粉碎后的待测样品（3 g)于25 mL具塞比色管中，加 入10 mL质量百分比为5%的三氯乙酸(含体积百分比为20%的甲醇）溶液，涡旋震荡混匀，超 声波震荡提取30 min，用去离子水定容，混勾，提取液于16000 r/min离心3 min，取上清液 过0.22 μπι的PTFE膜过滤到进样瓶中，得到待测溶液。
[0007] 所述步骤2)分析方法色谱条件为:采用CAPCELL CR(1:4)色谱柱(5 μπι，2.0 mmX 150 mm);流动相:A相为20 mmol/L乙酸铵(含体积百分比为0.0067%的甲酸），B相为甲醇， 梯度洗脱：0.0-0.5 min，70-25% Α;0·5-3·0 min，25% Α;3·0-6·0 min，70% A; 6.0-8.0 min，70% Α;流速:400 yL/min，柱温:35°C;进样量：10 yL;分析方法质谱条件为：电离源为 电喷雾正离子模式(ESI + );多反应监测（MRM);特征离子：1_甲基咪唑（1-ΜΕΙ)母离子为 83.0，定量子离子42.0，定性子离子56.0; 2-MEI母离子83.0，定量子离子42.0，定性子离子 56.0 ; 4-MEI母离子83.0，定量子离子56.0，定性子离子42.0; 4-MEI-d5同位素内标母离子 88.0，子离子60.0;采用氘代4-MEI同位素标准品为内标，进行2-MEI和4-MEI含量测定。
[0008] 本发明针对现有LC-MS/MS及UPLC-MS/MS检测方法中存在的样品前处理繁琐、成本 高等不足，提供一种前处理简单、快速准确、低成本并能有效分离1-MEI、2-MEI和4-MEI三种 同分异构体的烘焙食品中2-MEI和4-MEI的检测方法。与现有技术相比较，本发明具有以下 突出优点： 1、采用CAPCELL CR(1:4)色谱柱，增强了目标化合物的保留，使同分异构体1 -MEI、2-MEI和4-MEI及其它杂质分离完全，有效降低了离子抑制效应，提高了灵敏度，检测限低、准 确性好。
[0009] 2、本方法无需固相萃取等复杂的样品前处理程序，能有效分离甲基咪唑的三种同 分异构体并有效降低了离子抑制效应，提高了灵敏度，具有检测限低、准确性好的优点。 [0010]本方法采用三氯乙酸沉淀样品中的蛋白，加入甲醇使胶质等杂质沉淀，易于获得 澄清溶液，避免了固相萃取等前处理造成的目标化合物的损失，大大提高了检测效率，节约 了成本，同时降低了实验人员因前处理过程中使用毒性试剂所面临的健康威胁。
【附图说明】
[0011] 图1为l-MEI、2-MEI和4-MEI标准品的一级质谱图； 图2为1-MEI、2-MEI和4-MEI标准品的二级质谱图； 图3为4-MEI-d5标准品的一级质谱图； 图4为4-MEI-d5标准品的二级质谱图； 图5为1-MEI、2-MEI和4-MEI标准品的色谱图； 图6饼干中2-MEI和4-MEI的色谱图。
【具体实施方式】
[0012] 以下结合实施例对本发明作进一步说明。（但不是对本发明的限制）。
[0013] 本发明提供的烘焙食品中2-MEI和4-MEI的检测方法包括如下步骤： 1) 直接在样品加入三氯乙酸和甲醇混合溶液以沉淀蛋白质及胶质等杂质，超声提取， 定容，提取液经离心、过滤得到待测溶液； 2) 将经步骤1)得到的待测液采用CAPCELL CR(1:4)色谱柱(5 μπι，2.0 mmX150 mm)进 行分离，同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法对烘焙食品中2-MEI和4-MEI进行定性和定 量分析。
[0014]本发明的烘焙食品中2-MEI和4-MEI的检测方法，具体为:称取研磨粉碎后的待测 样品（3 g)于25mL具塞比色管中，加入10 mL质量百分比为5%的三氯乙酸(含体积百分比为 20%的甲醇)溶液，涡旋震荡混匀，超声波震荡提取30 min，用去离子水定容，混匀，提取液于 16000 r/min离心3 min，取上清液过0.22 μπι的PTFE膜过滤到进样瓶中得到待测溶液。 [0015] 所述的烘焙食品中2-ΜΕΙ和4-ΜΕΙ检测方法的色谱条件为:采用CAPCELL CR( 1:4) 色谱柱（5 μηι，2·0 mmX150 mm);流动相：A相为20 mmol/L乙酸铵（含体积百分比为 0.0067%的甲酸），8相为甲醇;梯度洗脱:0.0-0.5 11^11，70-25%八;0.5-3.0 11^11，25%八;3.0-6.0 min，70% A; 6.0-8.0 min，70% A;流速:400 yL/min，柱温：35°C;进样量：10 yL。质谱 条件为：电离源为电喷雾正离子模式(ESI+)，多反应监测(MRM);特征离子：1-MEI的母离子 为83.0，定量子离子42.0，定性子离子56.0; 2-MEI的母离子为83.0，定量子离子42.0，定性 子离子56.0; 4-MEI的母离子为83.0，定量子离子56.0，定性子离子42.0; 4-MEI-d5同位素内 标的母离子为88.0,子离子60.0;采用氘代4-MEI同位素标准品为内标，进行2-MEI和4-MEI 的含量测定。
[0016] 所述的烘焙食品中2-MEI和4-MEI检测方法涉及的检测仪器、耗材及化学试剂、标 准品有:超高效液相色谱串联四级杆质谱仪，配电喷雾离子源(ESI);离心机(转速2 10000 r/min)、涡旋混合器、分析天平、组织捣碎机、移液器；色谱柱：CAPCELL CR( 1: 4)，5 μπι， 2.0mmX 150 mm; 1-ΜΕΙ、2-ΜΕΙ和4-MEI标准品，氘代4-MEI标准品；乙腈(色谱纯）、甲醇(色 谱纯）、超纯水等;其他试剂均为分析纯。
[0017] 所述的检测条件： 液相条件：采用CAPCELL CR(1:4)色谱柱（5 ym，2.0mmX150 mm);流动相:A相为20 mmol/L乙酸铵(含体积百分比为0.0067%的甲酸），B相为甲醇，梯度洗脱:0.0-0.5 min，TOSS% Α;0·5-3·0 min，25% Α;3·0-6·0 min，70% A; 6.0-8.0 min，70% A。流速 ：400 yL/min， 柱温:35°C，进样量:10 yL。
[0018] 质谱条件：电离源为电喷雾正离子模式(ESI+);多反应监测(MRM);毛细管电压3.50 KV;源温度120°C;脱溶剂气温度400°C;脱溶剂气流量700 L/h，碰撞室压力：2.7x10-3 mbar， 特征离子及其它质谱参数见表1，采用氖代4-MEI标准品为内标，进行2-MEI和4-MEI的含量 测定。
[0019] 表1 2-MEI、4-MEI和4-MEI-d6的质谱分析条件
注:*为定莖尚子 具体地，本发明所述待测样品中2-MEI和4-MEI的检测方法包括以下几个过程： (1)标准溶液的配制 1) 1 -MEI、2-MEI和4-MEI标准储备溶液:准确称取适量的1 -MEI、2-MEI和4-MEI标准 品，用乙腈溶解后并定容于容量瓶中，分别配成配制成浓度为532.5 yg/mL、843.9 yg/mL和 568.6 yg/mL的标准储备溶液，置于4°C冰箱中保存。
[0020] 2)同位素内标标准储备溶液:准确称取适量的氘代4-MEI标准品，用乙腈配制成 1768.7 yg/mL的标准储备溶液，置于4°C冰箱中保存。
[0021] 3H-MEI、2-MEI和4-MEI标准使用溶液:根据需要，临用时吸取一定量的1-MEI、 2-MEI和4-MEI标准储备溶液，用20%乙腈稀释配制成标准使用溶液，置于4°C冰箱中保存。 [0022] 4)同位素内标标准工作溶液:根据需要，临用时吸取一定量的同位素内标标准储 备溶液，用20%乙腈进行适当稀释，配制成同位素内标标准工作溶液，置于4°C冰箱中保存。
[0023] (2)确定检测的标准 1) 定性检测标准:每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括1个母离子，2个子 离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与 浓度相当的标准溶液谱图中对应的定性离子的