ko等）。斑块中 多功能蛋白聚糖的丧失可导致基质不稳定。
[0128] 这也被血管病变后观察到的多功能蛋白聚糖基因上调所证明。在动脉粥样化形成 的所有阶段也鉴定到多功能蛋白聚糖;在早期发生斑块的内膜中，还遍及晚期病变中以及 在充满脂质的坏死核心的边界上和斑块血栓界面上(Wight和Merrilees 2005)。这些观察 结果将多功能蛋白聚糖与脂质积累、炎症和血栓形成关联起来。此外，多功能蛋白聚糖在 ECM的组装以及弹性纤维原纤维形成的控制中起重要作用，这对于血管病期间ECM的重塑非 常重要(Wight和Merrilees 2005)。
[0129] 双糖链蛋白聚糖在动脉细胞生物学中的作用尚不清楚。一些免疫组织化学研究显 示，双糖链蛋白聚糖与人再狭窄病变中的I型和III型胶原蛋白的染色相关(Evanko等）。 [0130] 还通过产生双糖链蛋白聚糖基因无效突变的纯合BALB/cA小鼠进一步显示了双糖 链蛋白聚糖作为基质蛋白质的重要性，其中50 %的双糖链蛋白聚糖缺陷型雄性小鼠在生命 的前3个月内由于主动脉破裂而突然死亡。此观察结果表明双糖链蛋白聚糖对于主动脉壁 结构和功能的完整性来说是必需的，还表明了双糖链蛋白聚糖基因缺陷在人主动脉剥离和 破裂的发病中可能的作用。（Heegaard等2007)
[0131]其它研究显示，双糖链蛋白聚糖在灵长类动脉中是与弹性蛋白相关联的主要PG; 这些观察结果与人冠状动脉病中观察到的结果相似(Evanko等）。
[0132]核心蛋白聚糖已显示出与胶原蛋白结合并调节胶原纤维的形成(Brown和Vogel) (Danielson等）。
[0133] 蛋白酶谱
[0134] 蛋白酶水解肽键，并且导致粥样斑中的细胞外基质蛋白质例如胶原、蛋白聚糖和 弹性蛋白发生降解，参见表9。在动脉粥样硬化斑块中，发现了三种主要类型:金属蛋白酶类 (即MMP)、丝氨酸蛋白酶类和半胱氨酸蛋白酶类（即组织蛋白酶）。组织蛋白酶类和MMP导致 所有细胞外基质蛋白质降解。因为基质对于斑块稳定性来说是至关重要的，所以蛋白酶将 其从纤维帽除去可引起斑块的破裂(Stary H.C.)。
[0135] 在表9中列出了在动脉粥样硬化斑块中发现的多种蛋白酶。
[0136] 表9
[0137]
[0138] 表9在动脉粥样硬化斑块中检测到的蛋白酶
[0139] 怀疑斑块中MMP表达的主要来源与巨噬细胞和SMC活性有关。斑块中的巨噬细胞含 有丰富的丽P-l、-8、-9和-13,其与胶原和蛋白聚糖原位降解的位点共定位(Kunz J.)。此 外，我们的数据表明MMP-8和组织蛋白酶K定位于动脉粥样硬化斑块中。
[0140]基质金属蛋白酶(MMP)
[0141] MMP是一大组内肽酶，其能够降解ECM的多数组分。目前，已鉴定到超过25种MMP。金 属蛋白酶类的特征在于含有金属原子(通常为锌）的活性位点，并以酶原的形式分泌。特异 性组织抑制剂??ΜΡ调控MMP的活性。动脉粥样硬化斑块中发现有很多种MMP。它们最常位于 作为纤维帽边界的巨噬细胞中、SMC和巨噬细胞中的斑块肩部内，但很少在纤维帽内部鉴定 到(Kunz J.)〇
[0142] MMP根据其底物特异性分为不同的组：降解纤丝胶原（如I、II、III和V型胶原以及 蛋白聚糖）的胶原酶；降解蛋白聚糖、IV、V、VII型胶原和弹性蛋白的明胶酶;对蛋白聚糖和 弹性蛋白有活性的基质降解酶(Rouis M)。这三个亚类在动脉粥样硬化斑块的基质重塑方 面特别重要。
[0143]明胶酶
[0144] 不溶性弹性蛋白被MMP-2和-9消化，这两者都属于MMP的明胶酶家族。MMP-9在影响 动脉粥样硬化斑块的大小和组成上起到重要的作用。在不稳定的人动脉粥样硬化斑块中以 及斑块的脆弱区域中，已观察到MMP-9较高的表达和浓度。此外，与具有稳定心绞痛的患者 相比，在具有不稳定心绞痛的患者中更经常在冠状动脉斑块的细胞内发现MMP_9(表示活跃 合成）。血液MMP-9水平与冠状动脉粥样硬化相关地升高，预测不良的心血管事件 (Sundstrom和Vasan) juzuya等(2006)最近的研究显示MMP-2负责纤维帽中SMC的积累，由 此诱导斑块的不稳定。
[0145] 基质降解酶
[0146] MMP-3属于基质降解酶，其能够降解弹性蛋白和蛋白聚糖。Yamada等(2002)的研究 显示，MMP-3被证实可以是预测女性心肌梗死遗传风险的可靠手段。
[0147] 胶原酶
[0148] MMP-U-8和-13均已在动脉粥样硬化斑块中鉴定到，它们在这里降解蛋白聚糖以 及I型和III型胶原。
[0149] MMP-U-8和-13是胶原酶，其将胶原切割成两个片段，其进一步被MMP-2、_3或-9降 解。
[0150] MMP-8由中性粒细胞表达，不常见于人粥样斑中，但是已在动脉粥样硬化斑块中鉴 定到。MMP-8可能部分地负责纤维帽的降解，因为MMP-8具有I型胶原蛋白的偏好性(Herman 等），其降解I型胶原的活性是MMP-1和13的三倍。这得到了Turu等(2006)的支持，在该研究 中，具有脆弱斑块的患者血浆中MMP-8的含量显著高于具有稳定斑块的患者。
[0151] 已有报道MMP-13切割SLRPS，对双糖链蛋白聚糖具有高特异性。MMP-13在特异性切 割位点（... Gm/Vm)降解双糖链蛋白聚糖，这之前已由Monfort等(2005)证实，并且提出其 在骨关节炎中软骨退化的早期检测中起重要作用。
[0152] 组织蛋白酶
[0153] 人半胱氨酸组织蛋白酶由11个成员组成，包括组织蛋白酶B、K、L和S，其主要在细 胞的内体/溶酶体区室内表达。组织蛋白酶能够催化蛋白聚糖、胶原蛋白和弹性蛋白的水解 性降解。
[0154] 相比于正常主动脉，在腹主动脉瘤(AAA)中发现了高水平的组织蛋白酶S、K和L。正 常人血管SMC含有的组织蛋白酶K无法通过免疫染色检出，但是动脉粥样硬化斑块内的细胞 明显是阳性的。组织蛋白酶K定位于易于破裂的区域，例如纤维帽、斑块肩部以及斑块破裂 的实际部位(Chapman等）。发现在动脉粥样硬化斑块中组织蛋白酶S与弹性蛋白降解增加的 区域共定位，在组织蛋白酶S和K缺陷型小鼠中观察到动脉粥样硬化减少(Liu等）。
[0155] 组织蛋白酶L和K都降解数种蛋白聚糖以及I型和II型胶原蛋白，组织蛋白酶K在共 价交联的三螺旋内降解，而组织蛋白酶L仅在非螺旋端肽区域进行切割。组织蛋白酶Κ定位 于纤维帽和斑块肩部。正常动脉中组织蛋白酶Κ的表达极低。人早期动脉粥样硬化病变中显 示在内膜和中间的SMC中表达组织蛋白酶Κ。在晚期动脉粥样硬化斑块中，组织蛋白酶Κ主要 定位于纤维帽的巨噬细胞和SMC中（Lutgens等）。与正常动脉相比，动脉粥样硬化病变中组 织蛋白酶K蛋白水平提高，而组织蛋白酶K的mRNA水平在动脉粥样硬化动脉和正常动脉中相 似。此外，已显示与早期动脉粥样硬化病变和包含血栓的病变相比，蛋白酶K mRNA和蛋白水 平在晚期但稳定的人动脉粥样硬化斑块中组织是最高的(Chapman等）。
[0156] 在早期人动脉粥样硬化病变和脂肪条纹的内膜和中间SMC中，组织蛋白酶S仅稀少 地表达。在晚期动脉粥样硬化斑块中，组织蛋白酶S定位于纤维帽的巨噬细胞和SMC中。沿血 管本身以及斑块微血管的腔排列的EC也表达组织蛋白酶S。此外，与正常动脉相比，人粥样 斑中组织蛋白酶S mRNA和蛋白水平升高（Lutgens等）。组织蛋白酶S可降解蛋白聚糖、弹性 蛋白和胶原蛋白（Liu等）。
[0157]目前，CVD风险的确定是在动脉粥样硬化发展的晚期阶段进行的;此时具有显著的 纤维斑块破裂的风险。需要一种在较早阶段和晚期阶段都提供动脉粥样硬化或CVD风险之 相关信息的诊断或预后测定。Katsuda等（1992)的发现表明，存在将胶原蛋白从晚期病变中 除去的酶促机制，实际上提示了新表位在动脉硬化中的重要作用。
[0158] 本发明提供了一种对包含新表位的肽片段进行定量的生物测定法，所述新表位是 由蛋白酶切割动脉粥样硬化斑块的蛋白质而形成的，所述方法包括使包含所述肽片段的样 品与对所述新表位具有特异性结合亲和力的免疫结合配偶体相接触，以及测定所述样品中 所述免疫结合配偶体与肽片段结合的水平。
[0159] 所述测定的结果可产生指示特定患者中动脉粥样硬化斑块破裂风险程度或者患 者动脉粥样硬化斑块脆弱状态的指标。
[0160] 可建议所述指标的值高于阈值水平的患者通过斑块成像方法(包括上文所述的那 些)进行进一步研究，或者建议其服用治疗动脉粥样硬化的药物或者进行动脉粥样硬化的 手术治疗，这些后续研究或治疗可构成本发明方法的一部分。
[0161] 动脉粥样硬化斑块的蛋白质包括光亮蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、基底膜蛋白聚 糖、核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、III型胶原、CRP、Ap 〇E和弹性蛋白。不认为I型胶原是动 脉粥样硬化斑块的蛋白质。动脉粥样硬化斑块中存在的以比体内其它地方更高的水平暴露 于蛋白酶的蛋白质是特别有意义的。
[0162] 所述免疫学结合配偶体可对包含C端新表位或N端新表位的肽片段具有特异性结 合亲和力。
[0163]蛋白聚糖测定
[0164]所述肽片段可以是蛋白聚糖多功能蛋白聚糖（SEQ ID N0:1)、光亮蛋白聚糖（SEQ ID N0:2)、基底膜蛋白聚糖（SEQ ID N0:3)、双糖链蛋白聚糖（SEQ ID N0:4)和核心蛋白聚 糖(SEQ ID N0:5)的片段，其全部都在正常和动脉粥样硬化的动脉中鉴定到。蛋白聚糖与弹 性蛋白和胶原蛋白是构成动脉粥样硬化斑块和斑块帽的主要蛋白质中的一部分。蛋白聚糖 含量在动脉粥样硬化发展过程中发生变化，使得蛋白聚糖的新表位有可能成为疾病分期和 疾病发展的良好标志物。尤其是因为多功能蛋白聚糖和光亮蛋白聚糖在许多其它器官中并 不丰富，这使得它们成为更具特异性的生物化学标志物的候选。
[0165] -些候选蛋白酶可能负责消化斑块中的蛋白聚糖，因为文献中报道了动脉粥样硬 化斑块中的许多不同的蛋白酶。最可能的是，这是最终导致斑块破裂的一系列复杂过程的 结果。但是，在我们的评估中，早期阶段可以由一组MMP组成，而晚期阶段可更多地依赖于组 织蛋白酶对基质的降解，根据疾病阶段而产生不同的新表位谱。我们确定了表4中所列酶产 生光亮蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、基底膜蛋白聚糖和核心蛋白聚糖，得 到至少下列切割产物：
[0166]
[0167]
[0168]
[0169]表4、蛋白酶产生的肽一一蛋白聚糖的切割产物。*代表切割位点 [0170]因此，在本发明的方法中，所述肽片段优选包含蛋白酶在其上述任一部分序列 中*号标明的位点切割多功能蛋白聚糖、光壳蛋白聚糖、基底U吴蛋白聚糖、核心蛋白聚糖或 双糖链蛋白聚糖而形成的新表位。
[0171] 另外，在本发明的方法中，所述肽片段优选包含通过一种(或多种)蛋白酶在下列 任一多功能蛋白聚糖、光亮蛋白聚糖、基底膜蛋白聚糖、核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖部 分序列中的位点切割下列蛋白聚糖而形成的新表位:多功能蛋白聚糖、光亮蛋白聚糖、基底 膜蛋白聚糖、核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖;或者所述免疫结合配偶体可与下列序列之 一特异性反应：
[0172]
[0173]
[0174] 表10、蛋白聚糖切割的肽片段。
[0175] 优选地，所述免疫结合配偶体不与完整的多功能蛋白聚糖、光亮蛋白聚糖、核心蛋 白聚糖、基底膜蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖反应。优选地，如果延长经过所产生片段的相应 C端和N端，则所述免疫结合配偶体不与上文所列的序列反应。
[0176] 免疫结合配偶体可与切割多功能蛋白聚糖、光亮蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、基底膜 蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖类型而形成的C端或N端新表位特异性反应。
[0177] 因此，合适的免疫结合配偶体可与肽N端的表11中下列任一序列特异性反应：
[0178]
[0179]
[0180]表11、蛋白酶广生的蛋白聚糖妝片段的N端序列
[0181] 或者与肽C端的表12中下列任一序列反应：
[0182]
[0183]
[0184]表12、蛋白酶广生的蛋白聚糖妝片段的C端序列
[0185] 通过将蛋白聚糖或其它动脉粥样硬化斑块蛋白质暴露于本文所述的任何酶以及 分离并测序由此产生的肽，可以鉴定出限定能以类似方式测定的新表位的其它切割位点。
[0186] 胶原蛋白测定
[0187]所述肽片段可以是III型胶原蛋白的片段(SEQ ID N0:153)，优选成熟III型胶原 蛋白，g卩非III型胶原蛋白前肽。动脉粥样硬化斑块中主要的蛋白质是I型和III型胶原蛋白 以及弹性蛋白，而蛋白聚糖仅仅对斑块的基质有次要的贡献。在动脉粥样硬化斑块中发现 的三种主要蛋白质中，I型和III型胶原蛋白占优势地位，而弹性蛋白在动脉的蛋白质谱中 占有优势，但不是斑块的主要蛋白质成分。I型胶原蛋白在体内各处都很丰富，而III型具有 更有限的组织定位，由此(按照我们的观点)是更特异性的生物化学标志物候选。
[0188] -些候选蛋白酶可能负责消化斑块中的胶原，因为文献中报道了动脉粥样硬化斑 块中的许多不同的蛋白酶。最可能的是，这是最终导致斑块破裂的一系列复杂过程的结果。 但是，在我们的评估中，早期阶段可以由一组MMP组成，而晚期水平可更多地依赖于组织蛋 白酶K对基质的降解，导致根据疾病水平产生不同的新表位谱。我们确定了下表中所列的酶 在至少下列切割位点(记为*)切割III型胶原蛋白：
[0189]
[0190]
[0191]
[uiyzj
[0193]
[0194]
[(一
[0196] 因此，在本发明的方法中，所述肽片段优选包含由蛋白酶在上述任一III型胶原蛋 白部分序列中*号标明的位点切割III型胶原蛋白而形成的新表位。
[0197] 另外，在本发明的方法中，所述肽片段优选包含由一种(或多种）蛋白酶在上述任 一 III型胶原蛋白的部分序列中的位点切割III型胶原蛋白而形成的新表位，或者所述免疫 结合配偶体与上表中任一项中*号之间的序列特异性反应。
[0198] 优选地，所述免疫结合配偶体不与完整的III型胶原蛋白反应。优选地，如果延长 经过相应的切割位点，则所述免疫结合配偶体不与上文所列的序列反应。
[0199] 所述免疫结合配偶体可以与切割III型胶原蛋白而形成的C端或N端新表位特异性 反应。
[0200] 因此，合适的免疫结合配偶体可以与肽N端的下列任一序列具有特异性反应性： (每个序列后为序列编号）
[0201]
[0202]
[0203] 或者与肽C端的下列任一序列具有特异性反应性：
[0204] L0205J
[0206] 通过将III型胶原蛋白或另一种动脉粥样硬化斑块蛋白质暴露于本文所述的任何 酶以及分离并测序由此产生的肽，可以鉴定出限定能以类似方式测定的新表位的其它切割 位点。
[0207] CRP 和 ApoE 测定
[0208] 所述肽片段可以是CRP(SEQ ID N0:658)或ApoE(SEQ ID N0:659)的片段。对于 ApoE，优选所选片段在所鉴定的全部ApoE同种型ε2、ε3和ε4中都存在。
[0209] 尽管CRP和ApoE在人体各处都很丰富，但它们在动脉粥样硬化组织中的定位使其 暴露于局部蛋白酶的作用。因此，这些分子是作为生物化学标志物的良好且特异的候选。
[0210] 一些候选蛋白酶可能负责消化斑块中的CRP和ApoE，因为文献中报道了动脉粥样 硬化斑块中的许多不同的蛋白酶。最可能的是，这是最终导致斑块破裂的一系列复杂过程 的结果。但是，在我们的评估中，早期阶段可以由一组MMP组成，而晚期水平可更多地依赖于 组织蛋白酶K对基质的降解，导致根据疾病水平产生不同的新表位谱。通过大量纯化天然蛋 白质的体外切割，我们确定了下表中所列的酶在至少下列切割位点（记为*)切割CRP和 ApoE：
[0211]表13、特异性蛋白酶产生的CRP和ApoE片段。
[0212]
[0214]因此，在本发明的方法中，所述肽片段优选包含由蛋白酶在下列任一CRP和ApoE部 分序列中以*标记的位点切割CRP和ApoE而形成的新表位，或者所述免疫结合配偶体与下 述序列之一的*号之