槲皮素调控NAFLD大鼠硬脂酰辅酶A去饱和酶及肝X受体α基因的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及非酒精性脂肪性肝病的病理及发病机制研究领域，特别涉及槲皮素调 控NAFLD大鼠硬脂酰辅酶Α去饱和酶及肝X受体α基因的方法。
【背景技术】
[0002]非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种与膜 岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏损伤，其病理学改变与酒精性肝病相似， 但患者无过量饮酒史，疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相关 肝硬化和肝细胞癌。随着肥胖和代谢综合征在全球的流行，NAFLD的发病率呈逐年增加。在 我国NAFLD呈现高发病率和低龄化趋势。NAFLD的发病机制尚不十分明确，目前广泛接受的 是Day和James提出的"二次打击"学说，认为肝细胞脂肪积聚和脂肪变性构成"初次打击"进 一步在细胞内脂质过氧化和氧化应激、炎性细胞因子等因素作用下形成"二次打击"，诱导 了肝脏炎症反应、肝细胞变性坏死和肝纤维化/肝硬化的发生。目前观点认为治疗NAFLD的 首要目标是改善IR，次要目标是防止二次打击和肝功能失代偿，减少或防止肝癌、肝硬化及 并发症的发生。
[0003] 脂质在肝脏中的蓄积是NAFLD的特征，也是其发生发展的关键环节。硬脂酰辅酶A 去饱和酶1(SCD1)是脂质合成的核心酶，催化单不饱和脂肪酸的合成。Wang等通过建立高脂 饮食诱导的NAFLD模型证实，槲皮素能够抑制肝脏脂酸的合成，减轻肝脏脂质蓄积。肝X受体 α基因（FXR-α)是细胞内重要的核受体。研究证实FXR-α参与了胆固醇和甘油三酯的合成、吸 收、转运、排泄等过程，在胆固醇、甘油三酯代谢中起关键作用。
[0004] 目前治疗NAFLD尚无特效药物，且现临床使用的大部分药物在治疗的同时还存在 一定副作用，疗效也无法肯定。NAFLD患病率在我国逐年升高，亟需找到一种安全、有效、价 廉物美的治疗药物。槲皮素 (quercetin)是从植物中提取除的一种黄酮类化合物，广泛存在 于许多植物的花、叶、果实中，多以甙的形式存在。大量研究证明槲皮素是一种安全性很高 的药物，且槲皮素具有抗炎、抗氧化、减少脂质合成、改善胰岛素抵抗等作用，有望成为治疗 NAFLD的潜在药物，目前尚无槲皮素对SCD1和FXR-a影响的报道。本研究拟通过高脂喂养建 立NAFLD动物模型观察槲皮素对NAFLD的治疗作用;通过动物模型研究SCD1和FXR-a在NAFLD 中的作用;在动物模型上观察槲皮素对NAFLD的治疗效果及NAFLD中槲皮素的疗效是否与调 节S⑶1和FXR-a的表达有关，为槲皮素的进一步临床研究提供理论基础。
【发明内容】
[0005] 为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供槲皮素调控NAFLD大鼠 硬脂酰辅酶A去饱和酶及肝X受体α基因的方法，
[0006] 为达到上述目的，本发明的技术方案为：
[0007] -种槲皮素调控NAFLD大鼠硬脂酰辅酶A去饱和酶及肝X受体α基因的方法，通过采 用高脂饮食诱导大鼠非酒精性脂肪肝模型；之后利用光镜、HE染色观察各组大鼠治疗前后 组织学的变化;从而检测各组小鼠治疗前后SCDl、LXRa含量和活性的表达，完成槲皮素对非 酒精性脂肪性肝病干预作用的评估，了解槲皮素治疗非酒精习惯脂肪性肝病的可能机制。
[0008] 进一步的，一、实验材料
[0009] ⑴实验动物:雄性SD大鼠
[0010] ⑵饲料配制:普通饲料（由泸州医学院实验动物中心提供）；
[0011 ]高脂饲料：由88 %的普通饲料，10 %的猪油和2 %的胆固醇组成。
[0012] 二、建立非酒精性肝病动物模型，选取48只SD雄性大鼠，正常喂养一周，随机分为 正常对照组（16只）和NAFLD组（40只），分别给予普通饲料和高脂饮食喂养，8周末处死NA FLD组大鼠8只和正常对照8只，取肝脏进行病理学检查，证实造模成功后，将余下NAFLD大鼠 32只分为三组：（1)NAFLD对照组8只，继续饲以高饲料，予以等体积生理盐水灌胃；（2)槲皮 素低剂量治疗组8只，同样继续饲以高饲料，并予槲皮素75mg kg< · cf1灌胃给药。（3)槲皮 素中剂量治疗组8只，同样继续饲以高饲料，并予槲皮素300mg kg^1 · cf1灌胃给药(4)槲皮 素高剂量治疗组8只，同样继续饲以高饲料，并予槲皮素600mg kg< · cf1灌胃给药。12周末 禁食12h后处死所有动物，采集标本，运用生物技术及病理组织检查等进行检测诊断，常规 制备血清、肝组织石蜡切片并保留少量肝组织用于RNA的检测。
[0013] 三、标本采集及处理，
[0014] A:血清分离
[0015] 实验结束后，动物禁食12h，用10%的水合氯醛以0.35ml/100g体重经腹腔内注射 麻醉后开腹，腹主动脉采血，室温静置15min，3000rpm离心15min分离血清，-70°C冰箱冻存， 备测血脂、血清转氨酶(ALT，AST，TG，TC)等生化指标。免疫组化检测相关蛋白。
[0016] B:组织学标本制备
[0017] 各组大鼠于肝右叶相同部位取0.5g肝组织置于1.5mlEP管，-70°C冰箱保存，用于 RT-PCR的检测；另取肝左叶相同部位lcmXlcmX0.5cm组织，置于4%的多聚甲醛中固定24-48h，自来水冲洗24h，经逐级乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋切片，常规HE染色，光镜 下观察肝组织病理学改变。
[0018] 四、观察指标及检测方法：
[0019] 1、一般情况:大鼠处死前后称重、体长，以及观察大鼠食欲、皮肤、毛发情况，处死 大鼠后观察肝脏形态体积、质地弹性等以及称肝脏湿重、计算肝指数（肝湿重/体重X 100%)及Lee · S指数(体重 1/3/体长X 1000)。
[0020] 2、血清生化测定:将采集的全血用低温离心机迅速分离血浆，采用全自动生化分 析仪(Olympus AulOOO)测定A1T、AST、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)以及肝组织匀浆脂质水 平、血清游离脂肪酸(FFA)水平;葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FBG);放免法测定血清空腹 胰岛素(FINS)水平;并计算胰岛素敏感指数ISI = ln[ 1/(F1NS XFBG)]。
[0021 ]五、病理学检查:取石蜡包埋好的肝组织，5um连续切片，常规苏木精-伊红染色，在 光镜下评估肝脂肪变性及纤维化程度、计算炎症活动度计分。脂肪肝病理组织学诊断参考 中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组"非酒精性肝病诊断标准"
[0022] 六、免疫组化测SCD1、LXR-α的蛋白水平
[0023] 七、半定量RT-PCR技术检测肝脏SCDl、LXR_a的表达(采用半定量RT-PCR法，按照 Trizol试剂盒说明提取大鼠肝组织总RNA，反转录合成cDNA。）
[0024] 1.PCR反应引物设计和合成
[0025] PCR引物参照有关文献设计
[0026] SCDlmRNA引物：
[0027] FORWARD 5'-CTACACAACCACCACCACCA-3'
[0028] REVERSE 5,-CAGGGCACCCATCAGATAGT-3，
[0029] FXR-amRNA引物：
[0030] FORWARD 5'-ACAAGGCTGCCCCGACTAC-3'
[0031] REVERSE 5'-TTTCTCCTGGTATGAGATAGCAAATC-3'
[0032] 2.总 RNA 提取
[0033] 采用Trizol法提取总RNA
[0034] 2.1组织匀浆：
[0035] (l)[i7]切取并称重100mg-70°C保存的冰冻SD大鼠肝脏组织置于高温高压消毒后 研钵内，倒入液氮，迅速研碎；
[0036] (2)每100mg均衆组织标本中加入lml的Trizol，混勾吹