水灌胃；（2)槲皮 素低剂量治疗组8只，同样继续饲以高饲料，并予槲皮素75mg kg< · cf1灌胃给药。（3)槲皮 素中剂量治疗组8只，同样继续饲以高饲料，并予槲皮素300mg kg^1 · cf1灌胃给药(4)槲皮 素高剂量治疗组8只，同样继续饲以高饲料，并予槲皮素600mg kg< · cf1灌胃给药。12周末 禁食12h后处死所有动物，采集标本，运用生物技术及病理组织检查等进行检测诊断，常规 制备血清、肝组织石蜡切片并保留少量肝组织用于RNA的检测。
[0093]三、标本采集及处理，
[0094] A:血清分离
[0095] 实验结束后，动物禁食12h，用10%的水合氯醛以0.35ml/100g体重经腹腔内注射 麻醉后开腹，腹主动脉采血，室温静置15min，3000rpm离心15min分离血清，-70°C冰箱冻存， 备测血脂、血清转氨酶(ALT，AST，TG，TC)等生化指标。免疫组化检测相关蛋白。
[0096] B:组织学标本制备
[0097] 各组大鼠于肝右叶相同部位取0.5g肝组织置于1.5mlEP管，-70°C冰箱保存，用于 RT-PCR的检测；另取肝左叶相同部位lcmXlcmX0.5cm组织，置于4%的多聚甲醛中固定24-48h，自来水冲洗24h，经逐级乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋切片，常规HE染色，光镜 下观察肝组织病理学改变。
[0098]四、观察指标及检测方法：
[0099] 1、一般情况:大鼠处死前后称重、体长，以及观察大鼠食欲、皮肤、毛发情况，处死 大鼠后观察肝脏形态体积、质地弹性等以及称肝脏湿重、计算肝指数（肝湿重/体重X 100%)及Lee · s指数(体重 1/3/体长X 1000)。
[0100] 2、血清生化测定:将采集的全血用低温离心机迅速分离血浆，采用全自动生化分 析仪(Olympus AulOOO)测定A1T、AST、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)以及肝组织匀浆脂质水 平、血清游离脂肪酸(FFA)水平;葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FBG);放免法测定血清空腹 胰岛素(FINS)水平;并计算胰岛素敏感指数ISI = ln[ 1/(F1NS XFBG)]。
[0101]五、病理学检查:取石蜡包埋好的肝组织，5um连续切片，常规苏木精-伊红染色，在 光镜下评估肝脂肪变性及纤维化程度、计算炎症活动度计分。脂肪肝病理组织学诊断参考 中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组"非酒精性肝病诊断标准"
[0102] 六、免疫组化测S⑶l、LXR-a的蛋白水平
[0103] 七、半定量RT-PCR技术检测肝脏SCDl、LXR_a的表达(采用半定量RT-PCR法，按照 Trizol试剂盒说明提取大鼠肝组织总RNA，反转录合成cDNA。）
[0104] 1.PCR反应引物设计和合成
[0105] PCR引物参照有关文献设计
[0106] SCDlmRNA引物：
[0107] FORWARD 5,-CTACACAACCACCACCACCA-3'
[0108] REVERSE 5,-CAGGGCACCCATCAGATAGT-3，
[0109] FXR-amRNA引物：
[0110] FORWARD 5'-ACAAGGCTGCCCCGACTAC-3'
[0111] REVERSE 5'-TTTCTCCTGGTATGAGATAGCAAATC-3'
[0112] 2.总 RNA 提取
[0113] 采用Trizol法提取总RNA
[0114] 2.1组织匀浆：
[0115] (l)[i7]切取并称重100mg-70°C保存的冰冻SD大鼠肝脏组织置于高温高压消毒后 研钵内，倒入液氮，迅速研碎；
[0116] (2)每100mg均衆组织标本中加入lml的Trizol，混勾吹打；
[0117] (3)将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，颠倒混匀后，室温放置5min[ i8]，以彻 底分离核蛋白复合体。
[0118] 2.2分离阶段:每111111^2〇1加入0.2 1111的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃153，充分混 勾，在室温放置3min，然后离心12,000rpm，15min，4°C。离心后分成三层，下面的红色为酸_ 氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。RNA只存在于水相中。水相占总Trizol的60%。
[0119] 2.3RNA的沉淀：将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入等体积（0.5ml)异丙 醇，室温静置l〇min，然后4°〇，12,000印 111，101^11离心，可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样 沉淀，即RNA沉淀。
[0120] 2.4RNA的洗涤：小心去除上清，留取沉淀，加入lml现配的75 %乙醇洗涤RNA沉淀， 振荡混勾，使沉淀物混悬，4°C，8000rpm，5min离心。
[0121 ] 2.5RNA的再溶解:小心去除上清，RNA沉淀物室温风干后，（不完全干燥），加入25ml 的DEPC处理过的无菌去离子水，用枪头反复吹打几次，室温静置10min，55-60°C，测浓度后_ 20°C保存。
[0122] 2.6紫外分光光度法检查RNA浓度和纯度:将仪器调零，取2μ1储存液加入另一个EP 管中，再加入98μ1灭菌注射用水，离心混匀，以灭菌注射用水作空白对照。
[0123] 2.7RNA鉴定，琼脂糖电泳，确定抽提RNA完整性和DNA污染情况。
[0124] 用氯仿-异丙醇-75%乙醇法常规操作提取RNA，按逆转录试剂盒说明书操作.
[0125] 3.逆转录成cDNA
[0126]①合成cDNA的引物可结合实际情况从01 igo dT-Adaptor Primer，Random 9mers 或特异性下游引物中任选一种。
[0127] 按下列组成配制反转录反应液。 MgCI 2 μ 10 X RT Buffer 1 μL
[0128] RNase Free dH2D 3.75 μ] dNTP Mixture (-^10mM) 1 μL RNase Inhibitor 0,25 μL. AM￥ Reverse Transcriptase* 1 0.5 μL
[0129] 特异性下游引物 0.5 μL 实验样品RNA ( < 5u〇 ng t(似丨 RNA) 1 μL Total Θ μL/Sample
[0130] ②按以下条件进行反转录反应。
[0131]
[0132] 4.PCR 反应
[0133] ①按下列组成配制PCR反应液。 5XPCR Buffer 10 μ 1 灭菌蒸馏水28. 7 5 μ 1 TaKaRa Ex Taq HS 0. 25 μ 1 c〇134] 上游特异性PCR引物 aj μL 下游特异性PCR引物 0,5 μL Total 40 w1 /Sample
[0135] ②把B-①的反应液加入到A-②的反转录反应结束后的PCR反应管中，轻轻混匀。
[0136] ③按以下条件进行PCR反应
[0137]
[0138] 5.PCR产物半定量
[0139] 反应结束后，取PCR反应液(5~101)进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。如果 此PCR产物需用于以后实验，须将PCR产物冷冻保存。
[0140] 6.结果判定
[0141]采用凝胶图像分析系统，对电泳条带扫描分析。
[0142] 八、Western plot测磷酸化的LXR-α
[0143] 1.蛋白质样品获得:真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-lmin。然 后4°C，13，000g离心15min。取上清液作为样品。
[0144] 2.电泳:制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
[0145] 3.转移：（半干式转移）
[0146] (1)电泳结束后将胶条割至合适大小，