Pei纳米粒子构建的免疫传感器的制备方法及应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于新型功能材料和生物传感检测技术领域，尤其是涉及一种Ru-Si〇2@ PEI纳米粒子构建的免疫传感器的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 神经元特异性烯醇化酶(NSE)作为高特异性和高灵敏性的小细胞肺癌的肿瘤标记 物，被广泛的应用于医疗诊断。而且，NSE活性水平改变同小细胞肺癌的临床过程具有很好 的相关性。患者经治疗后，若肿瘤缩小，NSE水平明显降低，相反，若NSE在治疗过程中不降 低，临床上肿瘤也不见治疗反应。由于对NSE含量的测定可以为疾病的诊断及治疗情况提供 重要信息，目前已经发展了ELLSA法、荧光免疫法，电化学免疫法和化学发光法等对NSE水平 进行分析检测。然而，每种方法都有其优缺点，发展新的简单灵敏的NSE检测方法仍然十分 重要。
[0003] 电化学发光分析方法由于灵敏度高、操作简便和设备简单等优点被广泛用于环境 监测、药物分析、生物传感等领域。由于电化学发光物本身产生的发光信号较低，通常会在 体系中加入共反应剂来提高发光信号进而提高分析检测效果。近来，自增强电化学发光复 合物将发光物及其共反应剂同时负载到复合物上，缩短了电子传递距离，提高了发光效率， 使得体系发光信号大大提高的同时，避免了共反应剂的加入，从而进一步简化了电化学发 光检测体系。基于自增强电化学发光复合物构建的传感器，灵敏度高，选择性好且制备过程 简单。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种Ru-Si02@PEI纳米粒子构建的免疫 传感器的制备方法，主要用于神经元特异性烯醇化酶的检测，其具有灵敏度高、线性范围 宽、检测限低的特点。
[0005] 本发明是通过以下技术手段实现上述技术目的的。
[0006] 一种Ru-Si02@PEI纳米粒子构建的免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：
[0007] SI :Ru-Si〇2@PEI纳米粒子溶液的制备:将Ru-Si〇2纳米粒子水分散液加入聚乙烯亚 胺(PEI)中，经搅拌、离心分离，所得产物水洗，得到Ru-Si02@PEI纳米粒子水分散液；
[0008] S2:将玻碳电极抛光打磨、水洗后，在其表面滴加步骤S1中所述Ru-Si02@PEI纳米 粒子水分散液，晾干;再在玻碳电极表面滴加全氟磺酸溶液，晾干;随后将其放入氯金酸溶 液中电镀，得到表面沉积有金纳米粒子的电极A;
[0009] S3:步骤S2中得到的电极A在神经元特异性烯醇化酶抗体溶液中浸泡，4°C作用 12h，随后对电极清洗，得到电极B;
[0010] S4:将步骤S4中得到的电极B在牛血清白蛋白溶液中浸泡，清洗后制得基于Ru-Si02@PEI纳米粒子构建的免疫传感器。
[0011 ] 优选的，步骤si中所述Ru-Si〇2纳米粒子的制备过程如下:将7.08mL聚乙二醇辛基 苯基醚（Triton X-100)、30mL环己烷、7.2mL正己醇和1.36mL水混合成油包水微乳滴混合 液，然后加入320yL·^度为O.lmol/L的联吡啶钌(Ru(bpy) 32+)溶液，搅拌30min后，使混合液 混合均匀;接着依次加入400yL正硅酸乙酯和240yL氨水，持续搅拌24h;反应结束后，向体系 中加入30mL丙酮，静置30min后，下层沉淀先用乙醇洗四次再用二次蒸馏水洗四次；制得Ru-Si0 2纳米粒子，最后将得到的Ru-Si02纳米粒子分散到10mL水中备用。
[0012] 优选的，步骤S1中Ru-Si〇2纳米粒子溶液的浓度为0.5mg/mL，所述聚乙稀亚胺 (PEI)的浓度为5-40mg/mL，所述聚乙烯亚胺(PEI)和Ru-Si02纳米粒子溶液的体积比为1:1; 搅拌的时间为9-15h;所得产物水洗3次以上。
[0013] 优选的，步骤S2中所述玻碳电极的直径为3mm，玻碳电极采用AI2O3抛光粉打磨、超 纯水清洗;所述Ru-Si02@PEI纳米粒子溶液的浓度为0.1-0.9mg/mL，体积为5yL;所述全氟磺 酸溶液的质量浓度为〇.04%，体积为2yL;玻碳电极在质量浓度为1 %的氯金酸溶液中-0.2V 下电镀15s。
[0014] 优选的，步骤S3中所述电极清洗溶液为含0.5%Tween的0.01M的pH=7.4磷酸盐缓 冲液。
[0015] 优选的，步骤S4中在37°C下，电极B在牛血清白蛋白溶液中浸泡lh，之后用含0.5 % Tween的0.01M的pH = 7.4磷酸盐缓冲液清洗;所述神经元特异性稀醇化酶抗体溶液的浓度 为lyg/mL，体积为80yL。
[0016] 上述免疫传感器在检测神经元特异性烯醇化酶中的应用。
[0017] 优选的，包括如下步骤：
[0018] 将制得的传感器浸入到80yL的浓度为lOfg/mL-lOng/mL的不同神经元特异性稀醇 化酶溶液中，37°C下作用80min;之后用含0.5 %Tween的0.01M的pH=7.4磷酸盐缓冲液对电 极进行清洗，得到的电极作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极作为对 电极，电化学发光信号由MPI-E电化学发光分析仪记录和检测;在0.1M的pH = 7.5的磷酸盐 缓冲液中进行测试;扫描电压范围0-1.35V，扫描速度0.1 V.s'光电倍增管高压设为800V。
[0019] 本发明的有益效果：
[0020] (1)利用自增强电化学发光物构建免疫传感器，无需额外加入共反应剂，简化实验 步骤，节约实验试剂。
[0021] (2)本发明制备的电化学发光免疫传感器用于经元特异性烯醇化酶的检测，最优 条件下，检测线性范围为10fg/mL-10ng/mL，横跨七个数量级，检测限低至10fg/mL ;将构建 的传感器的分析效果与文献报道的其它方法进行比较，结果较好。
【附图说明】
[0022] 图1是Ru-Si02@PEI纳米粒子构建的传感器制备工艺过程图。
[0023] 图2是本发明中制备的Ru-S i 02@PE I纳米粒子的TEM图片。
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并 不限于此。
[0025] 实施例1
[0026] 如图1所示：
[0027] SI :Ru-Si02@PEI纳米粒子溶液的制备：
[0028] 将7.08mL聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100)、30mL环己烷、7.2mL正己醇和 1.36mL水混合成油包水微乳滴混合液，然后加入320yL·^度为0. lmol/L的联吡啶钌溶液，搅 拌30min后，依次加入400yL正娃酸乙酯和240yL氨水，持续搅拌24h;反应结束后，向体系中 加入30mL丙酮，静置30min后，下层沉淀先用乙醇洗四次再用二次蒸馏水洗四次，制得Ru-Si0 2纳米粒子，最后将得到的Ru-Si02纳米粒子分散到10mL水中备用；
[0029] 取10mL浓度为0.5mg/mL上述Ru-Si02纳米粒子水分散液加入10mL浓度为5mg/mL、 的聚乙烯亚胺(PEI)中，搅拌9h，离心并将所得产物用水洗涤3次，得到Ru-Si02@PEI纳米粒 子，见图2;
[0030] S2:将直径为3mm的玻碳电极经Al2〇3抛光粉打磨、超纯水清洗；取5yL 0.1mg/mL Ru-Si02@PEI纳米粒子溶液滴加到电极表面，室温下晾干；随后在电极表面滴加2yL质量浓 度0.04%全氟磺酸溶液(Naf ion)，室温下瞭干，防止Ru-Si〇2@PEI纳米粒子从电极上掉落；； 随后放入质量浓度为1 %的氯金酸(HAuC14)溶液中，在-0.2V下电镀15s，表面沉积金纳米粒 子，用于连接目标抗原;得到电极A;
[0031] S3:将电极A在80yL lyg/mL神经元特异性烯醇化酶抗体溶液中浸泡，4°C下放置 12h;随后用包含0.5 % Tween的0.01M的pH=7.4磷酸盐缓冲液(PBS)清洗电极，得到电极B; [0032] S4:37°C下，将电极B在80yL浓度为1 %的牛血清白蛋白溶液(BSA)中浸泡lh，封闭 电极表面非特异性活性位点，之后用含0.5%Tween的0.01M的pH = 7.4磷酸盐缓冲液对电极 进行清洗，制得基于Ru-Si02@PEI纳米粒子构建的免疫传感器。
[0033] 实施例2
[0034] SI :Ru-Si02@PEI纳米粒子溶液的制备：
[0035] 将7.08mL聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100)、30mL环己烷、7.2mL正己醇和 1.36mL水混合成油包水微乳滴混合液，然后加入320yL·^度为0. lmol/L的联吡啶钌溶液，搅 拌30min后，依次加入400yL正娃酸乙酯和240yL氨水，持续搅拌24h;反应结束后，向体系中 加入30mL丙酮，静置30min后，下层沉淀先用乙醇洗四次再用二次蒸馏水洗四次，制得Ru-Si0 2纳米粒子，最后将得到的Ru-Si02纳米粒子分散到10mL水中备用；
[0036] 取10mL浓度为0 · 5mg/mL上述Ru_Si〇2纳米粒子水分散液加入10mL浓度为20mg/mL、 的聚乙烯亚胺(PEI)中，搅拌12h，离心并将所得产物用水洗涤3次，得到Ru-Si0 2@PEI纳米粒 子；
[0037] S2:将直径为3mm的玻碳电极经Al2〇3抛光粉打磨、超纯水清洗；取5yL 0.5mg/mL Ru-Si02@PEI纳米粒子溶液滴加到电极表面，室温下晾干；随后在电极表面滴加2yL质量浓 度0.04%全氟磺酸溶液(Naf ion)，室温下瞭干，防止Ru-Si〇2@PEI纳米粒子从电极上掉落；； 随后放入质量浓度为1 %的氯金酸(HAuC14)溶液中，在-0.2V下电镀15s，表面沉积金纳米粒 子，用于连接目标抗原;得到电极A;
[0038] S3:将电极A在80yL lyg/mL神经元特异性烯醇化酶抗体溶液中浸泡，4°C下放置 12h;随后用包含0.5 % Tween的0.01M的pH=7.4磷酸盐缓冲液(PBS)清洗电极，得到电极B; [0039] S4:37°C下，将电极B在80yL浓度为1 %的牛血清白蛋白溶液(BSA)中浸泡lh，封闭 电极表面非特异性活性位点，之后用含0.5%Tween的0.01M的pH = 7.4磷酸盐缓冲液对电极 进行清洗，制得基于Ru-Si02@PEI纳米粒子构建的免疫传感器。
[0040] 实施例3
[0041 ] SI :Ru-Si02@PEI纳米粒子溶液的制备：
[0042] 将7.08mL聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100)、30mL环己烷、7.2mL正己醇和 1.36mL水混合成油包水微乳滴混合液，然后加入320yL·^度为0. lmol/L的联吡啶钌溶液，搅 拌30min后，依次加入400yL正娃酸乙酯和240yL氨水，持续搅拌24h;反应结束后，向体系中 加入30mL丙酮，静置30min后，下层沉淀先用乙醇洗四次再用二次蒸馏水洗四次，制得Ru-Si0 2纳米粒子，最后将得到的Ru-Si02纳米粒子分散到10mL水中备用；
[0043] 取10mL浓度为0 · 5mg/mL上述Ru_Si〇2纳米粒子水分散液加入10mL浓度为40mg/mL、 的聚乙烯亚胺(PEI)中，搅拌15h，离心并将所得产物用水洗涤3次，得到Ru-Si0 2@PEI纳米粒 子；
[0044] S2:将直径为3mm的玻碳电极经Al2〇3抛光粉打磨、超纯水清洗；取5yL 0.9mg