间定义的序列特异性反应。
[0215] 表14、CRP和ApoE的切割片段。
[0216]
[0218] 因此，合适的免疫结合配偶体可以对肽N端的下列任一序列具有特异性反应性：
[0217]
[0219]
[0220]
[0221 ]或者对肽C端与下列任一序列具有特异性反应性：
[0222]
[0223]通过将CRP和ApoE或另一种动脉粥样硬化斑块蛋白质暴露于本文所述的任何酶以 及分离并测序由此产生的肽，可鉴定出限定可以类似方式测定之新表位的其它切割位点。 [0224]弹性蛋白测定
[0225]所述肽片段可以是弹性蛋白（SEQ ID N0:735)的片段。尽管弹性蛋白在人体各处 都很丰富，但它们在动脉粥样硬化组织中的定位使其暴露于局部蛋白酶的作用，因此这些 分子是作为动脉粥样硬化斑块周转的生物化学标志物的良好且特异的候选。
[0226] -些候选蛋白酶可能负责消化斑块中的弹性蛋白，因为文献中报道了动脉粥样硬 化斑块中的许多不同的蛋白酶。最可能的是，这是最终导致斑块破裂的一系列复杂过程的 结果。但是，在我们的评估中，早期阶段可以由一组MMP组成，而晚期阶段可更多地依赖于组 织蛋白酶K对基质的降解，根据疾病水平而产生不同的新表位谱。通过大量纯化天然蛋白质 的体外切割，我们确定了下表中所列的酶在至少下列切割位点(记为*)切割弹性蛋白：
[0227] 表15、特异性蛋白酶产生的弹性蛋白片段
[0228]
?〇229]^因此，在本发明的方法中，所述肽片段优选包含由蛋白酶在下列任一弹性蛋白部 分序列中以*号标记的位点切割弹性蛋白而形成的新表位，或者所述免疫结合配偶体对下 述序列之一中*号之间所定义序列具有特异性反应性。
[0230]表16、弹性蛋白的切割片段。
[0233]因此，合适的免疫结合配偶体可以与肽N端的下列任一序列具有特异性反应性: [0234]
[0231]
[0232]
[0235] 或者与肽C端的以下任一序列具有特异性反应性：
[0236]
[0237] 通过将弹性蛋白或另一种动脉粥样硬化斑块蛋白质暴露于本文所述的任何酶以 及分离并测序由此产生的肽，可鉴定出限定可以类似方式测定之新表位的其它切割位点。
[0238] 可分别对多于一种上述肽进行测定，并将其结果相结合，或者可同时测定多于一 种上述的肽。
[0239] 本发明测定的结果可以与一种或多种其它测定的生物标志物相结合，形成诊断或 预后值的复合指标。
[0240]本文使用的术语"免疫结合配偶体"包括多克隆抗体和单克隆抗体，以及抗体的特 异性结合片段例如Fab或FUbJs。因此，所述免疫结合配偶体可以是单克隆抗体或者具有 特异性结合亲和力的单克隆抗体片段。
[0241]本文使用的术语"蛋白质"包括脂蛋白和蛋白聚糖及其他蛋白质（非蛋白质）天然 缀合物。
[0242] 一般地，所有先前已知的免疫测定形式都可用于本发明，包括异质和均质的形式， 夹心法测定、竞争测定、酶联测定、放射性免疫测定等等。因此，任选地，所述方法以竞争性 免疫测定的形式进行，其中将所述免疫结合配偶体和竞争剂在所述样品存在下一起孵育， 所述竞争剂与样品中的肽片段竞争结合该免疫结合配偶体。
[0243] 所述竞争剂可以是合成肽，或是通过切割新表位所属蛋白以暴露新表位而形成的 纯化天然肽。因此，所述肽可来源于多功能蛋白聚糖、光亮蛋白聚糖、基底膜蛋白聚糖、核心 蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、III型胶原蛋白、ApoE、CRP或弹性蛋白中的任一种。
[0244] -种合适的方法可以是使用单克隆抗体或抗体结合片段进行的竞争免疫测定，所 述单克隆抗体或抗体结合片段与任一这些蛋白质片段中的新表位或者来自动脉粥样硬化 斑块的其他肽片段上的新表位结合。包被于微滴定板固体表面上的适当选择的合成肽可与 样品竞争结合所述单克隆抗体或结合片段。或者，带有单克隆抗体或结合片段所识别新表 位的一种或多种蛋白质的纯化天然片段可用于固体表面上。另一种替代方案是将单克隆抗 体或结合片段固定于固体表面，然后将样品与适当连接信号分子(例如辣根过氧化物酶或 生物素）的合成肽共孵育。所述样品可以是尿、血清、血、血浆或其它样品，例如动脉粥样硬 化斑块活组织检查。
[0245] 在某些优选方法中，所述样品是来自患者的样品，所述方法还包括将测得的所述 肽片段结合水平与下列特征值进行比较：（a)相当的健康个体和/或(b)病理动脉粥样硬化 状况，以及任选地将所测定较高的肽水平(通常由较高水平的结合来表示)与更严重的所述 状况程度相关联。
[0246] 本发明的一个方面涉及开发识别上述新表位的单克隆抗体。这可通过下述方案来 实现，用合成肽免疫小鼠，所述合成肽来自于目的蛋白质分子的氨基酸序列(包括上文所列 序列或者在其中终止的序列）；将来自所选小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合；以及测定单克 隆抗体与相关合成肽上新表位的结合。可通过要求与合成肽具有反应性但与C延长形式的 免疫肽(对于C端新表位)或者N端延长形式的免疫肽(对于N端新表位)无反应性，来确保新 表位的特异性。也可对针对新表位的抗体进行评估，以确定不能与天然蛋白质结合。或者， 可通过要求抗体反应性负依赖于与末端氨基酸之一共价连接的生物素或其他官能团的存 在，来确保对新表位的特异性。
[0247] 本发明包括对新表位具有特异性免疫反应性的免疫结合配偶体，所述新表位是通 过蛋白酶在任一上述部分序列的末端位点切割所述蛋白质而形成的，所述免疫结合配偶体 可以是例如单克隆抗体或其结合片段。
[0248] 本发明包括产生针对C端或N端新表位的单克隆抗体的细胞系，所述新表位是通过 在任一上述部分序列的序列末端位点切割动脉粥样硬化斑块蛋白质而形成的。
[0249] 本发明还提供包含C端或N端新表位的肽，所述新表位是通过在任一上述蛋白质部 分序列中切割所述蛋白质而形成的。这样的肽可以作为半抗原与载体缀合，用以产生对所 述肽的免疫应答，或者固定到固体表面或与可检测标记缀合用于免疫测定。
[0250] 本发明还包括编码包含C端或N端新表位的肽的分离核酸分子，所述新表位是通过 在任一上述部分序列中切割所述蛋白质而形成的。
[0251] 本发明还包括包含核酸序列的载体，所述核酸序列包含表达信号以及编码表达包 含C端或N端新表位的肽的编码序列，所述新表位是通过在任一上述部分序列中切割所述蛋 白质而形成的，本发明还包括用此载体转化并表达所述肽的宿主细胞。
[0252] 本发明的另一个方面涉及试剂盒，其可方便地用于实施上述方法。此试剂盒可包 含（1)用合成肽包被的微滴定板；（2)对所述合成肽具有反应性的本发明单克隆抗体或抗体 结合片段;和(3)带标记的抗小鼠 IgG免疫球蛋白。或者，此试剂盒可包含（1)用纯化的天然 蛋白质片段包被的微滴定板；（2)识别任一所述蛋白质片段上新表位并对所述纯化片段具 有反应性的单克隆抗体;和(3)带标记的抗小鼠 IgG免疫球蛋白。或者，此试剂盒可包含（1) 用链霉亲和素包被的微滴定板；（2)与生物素相连的合成肽；（3)识别所述蛋白质片段上新 表位并对所述合成肽具有反应性的单克隆抗体;和(4)带标记的抗小鼠 IgG免疫球蛋白。另 一种替代方案可以是包含以下的试剂盒：（1)用链霉亲和素包被的微滴定板；（2)与生物素 相连的合成肽；（3)识别所述蛋白质片段上新表位(并对所述合成肽具有反应性)并且与辣 根过氧化物酶缀合的单克隆抗体。
[0253] 因此，本发明包括免疫测定试剂盒，其包含如本文所述的免疫结合配偶体以及与 所述免疫结合配偶体结合的竞争剂，并任选地包含以下一种或多种:洗涤试剂、缓冲剂、终 止试剂、酶标记、酶标记底物、校准标准品、抗小鼠抗体和进行所述免疫测定的说明。
[0254] 本文所述测定可用于诊断患者的动脉粥样硬化疾病。另外，所述测定可用于评估 疾病进展并监测对治疗的反应。本发明的免疫结合配偶体还可用于免疫染色，以显示本文 所述任一动脉粥样硬化斑块蛋白质切割产物的存在情况或位置。
【附图说明】
[0255] 下面参考附图进一步解释和说明本发明，其中：
[0256] 图1显示使用单克隆小鼠抗体对具有III型病变的主动脉样品进行双糖链蛋白聚 糖染色(分别为2、4、4和10倍放大）。
[0257]图2显示使用单克隆小鼠抗体对具有III型病变的主动脉样品进行组织蛋白酶K染 色(分别为2、4、10和10倍放大）。
[0258] 图3显示使用单克隆小鼠抗体对具有V型病变的主动脉样品进行双糖链蛋白聚糖 染色(分别为2、4、10和10倍放大）。
[0259] 图4显示使用单克隆小鼠抗体对包含V型病变的主动脉样品进行组织蛋白酶K染色 (分别为2、4、10和10x倍放大）。
[0260] 图5显示通过以下蛋白酶产生的双糖链蛋白聚糖切割产物:MMP2、MMP3、MMP8J1K 蛋白酶K、组织蛋白酶S、组织蛋白酶B和组织蛋白酶L。]\1 = Rainbow标记物，-enz =未进行酶 消化，利用实施例2的凝胶进行。
[0261 ]图6至8显示实施例4所得的竞争研究结果。
[0262] 图9显示实施例6所得的竞争研究结果。
[0263] 图10和11显示实施例7所得的竞争研究结果。
【具体实施方式】
[0264] 实施例1
[0265] 为了分析蛋白聚糖和蛋白酶的定位，我们对来自于冠状动脉左前降支（left coronary descending arteries，LAD)的人动脉样品进行了免疫组织化学染色。下文中，证 明了组织蛋白酶K蛋白酶与双糖链蛋白聚糖共定位。
[0266] 如图1和2中所示的免疫组织化学染色显示了双糖链蛋白聚糖与组织蛋白酶K的共 定位。这可表明双糖链蛋白聚糖是组织蛋白酶K的优选底物。对主动脉样品进行了相同的免 疫组织化学染色，其中形成了动脉粥样硬化斑块，并因此导致巨噬细胞性泡沫细胞浸润物 和钙化替代了正常主动脉结构。这些免疫染色的结果汇总在图3和4中。
[0267]双糖链蛋白聚糖和组织蛋白酶K的免疫组织化学染色显示在发展的动脉粥样硬化 病变中共定位。综合这些结果产生了下列假说:双糖链蛋白聚糖中组织蛋白酶K的特异性切 割位点导致动脉粥样硬化病变中的新表位产生增加。为了检验这一假说，我们使用不同的 蛋白酶切割双糖链蛋白聚糖。
[0268] 实施例2
[0269] 用于评估降解片段的双糖链蛋白聚糖降解。通过下列蛋白酶切割来自牛关节软骨 的双糖链蛋白聚糖(B8041-Sigma-Aldrich):MMP2、MMP3、MMP8、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、 组织蛋白酶B和组织蛋白酶L。将由上述蛋白酶的酶促切割产生的蛋白聚糖片段在10% NllPage⑩Bis-Tris凝胶上分离，然后通过"Silver Express"银染试剂盒（Invitrogen目 录号LC6100,批号341099)进行银染。蛋白水解产生的双糖链蛋白聚糖的分离以及银染的结 果在图5中显示。
[0270] 实施例3
[0271] 用与卵白蛋白缀合的来自III型胶原的肽免疫小鼠。对血清筛选与缀合生物素的 所筛选肽序列的反应性。产生分泌单克隆抗体的克隆，并使用筛选序列进行筛选。检查克隆 的以下方面:缺少与延长形式靶标肽的反应性以及缺少与无义肽的反应性，所述延长形式 靶标肽延续了 III型胶原中的临近序列（反选肽）。所有靶序列阳性克隆均不与延长或无义 序列反应。
[0272] 所述靶序列、免疫原、筛选序列和反选序列如下：
[0273]
[0274] 实施例4
[0275] III型胶原蛋白新表位单克隆抗体与人尿的反应性
[0276] 在使用免疫肽作为竞争剂的竞争测定形式中确定来自实施例3的所选单克隆抗体 克隆与人尿的反应性。在典型方案中，在20°C下用PBS-BTE中10ng/ml生物素-肽对以链霉亲 和素包被的96孔板摇动包被30分钟，在洗涤缓冲液中洗涤5遍。加入20μ1稀释的样品（尿或 肽溶液）。添加如下文所述稀释的1〇〇μ1未纯化抗体溶液(来自细胞培养物的上清液）。将平 板在20°C下以300rpm摇动孵育1小时，然后在洗涤缓冲液中洗涤5遍。添加 100μΙ二抗(POD， 1:5000)，在20°C下以300rpm摇动孵育1小时，然后在洗涤缓冲液中洗涤5遍。添加 100μΙ ΤΜΒ，避光以300rpm摇动孵育15分钟，然后添加 100μΙ终止液。在ELISA读取仪上以450nm读取 平板，以650nm作为参照。这样，平板上的肽与溶液中的肽发生对抗体的竞争，通过过氧化物 酶显色反应确定与平板结合的抗体量。
[0277]四个不同克隆的结果显示于图6。可以看出，每种所述抗体都检测出尿中的相关序 列。
[0278]对一个选定的克隆进行另外的竞争研究，以测试免疫肽与被MMP9体外切割的天然 III型胶原蛋白之间对抗体结合的竞争。被切割的胶原、KNGETG肽和该序列延长形式的结果 显示于图7。可以看出，所述抗体结合免疫肽序列和被酶切割的胶原蛋白，但是不结合延长 的序列。
[0279]对同一克隆进行的其它竞争研究见于图8,其中竞争剂分别是KNGETG肽、人血清、 大鼠血清、FCS(胎牛血清)和动脉粥样硬化斑块提取物。可以看出，所述抗体与所述肽、所述 斑块提取物以及人血清反应，但是不与大鼠血清或FCS反应。
[0280] 实施例5
[0281 ]产生针对核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和多功能蛋白聚糖序列的抗血清 [0282]如实施例3中所述，产生抗血清并获得单克隆抗体，不同在于使用下列免疫原、筛 选序列和反选序列。
[02831
[0284] 实施例6
[0285] 核心蛋白聚糖新表位单克隆抗体与人尿的反应性
[0286] 基本如实施例5所述使用一种抗核心蛋白聚糖未纯化单克隆抗体(NB62)进行竞争 性ELISA。
[0287] 结果显示于图9。可观察到针对产生和选择该抗体的肽序列以及针对尿的反应性， 但针对无关肽序列NB18则不然。
[0288] 实施例7
[0289] 多功能蛋白聚糖新表位单克隆抗体与人尿的反应性
[0290] 基本如实施例5使用针对序列(NB64)产生的两种抗多功能蛋白聚糖未纯化单克隆 抗体克隆进行竞争性ELISA。
[0291] 各个克隆的结果显示于图10和11。在每种情况下，可观察到针对产生和选择该抗 体的肽序列以及针对尿的反应性，但是针对无关肽序列NB18则不然。
[0292] 在本说明书中，除非另外指明，否则词语"或"以下述运算符含义使用：当满足所述 情况之一或同时满足时返回真值，相反，运算符"异或"要求仅满足条件之一。词语"包含"以 "包括"的含义使用，而不表示"由......组成"。上文给出的在先教导通过引用并入本文。
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