一种同时检测含乳制品中多种糖及糖醇的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种牛奶、糕点、糖果、奶粉等含乳制品中糖和糖醇的检测方法，特别 涉及一种同时检测上述食品中山梨糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖的高 效液相色谱检测方法。
【背景技术】
[0002] 目前糖类检测方法的研究中，主要有高效液相色谱（HPLC)-荧光检测法(FLD)， HPLC-示差折光法(RID)，离子色谱法，高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS/MS)，高效气相 色谱质谱联用法(GC-MS/MShHPLC-FLD法虽然灵敏度较高，但是具有较强的选择性;离子 色谱法具有较好的重复性和准确性，但是糖类能在电极表面还原样品中某些分子;HPLC-MS/MS法和GC-MS/MS法虽然具有高分离、高选择、高灵敏的特性，但是其设备昂贵，操作复 杂，通用性较差;现行国标中对单、双糖、糖醇的检测方法主要为化学还原法和HPLC-示差折 光检测法(RID)，但前者费时，操作繁琐，并且只能对具有还原性的糖进行定量检测，无法准 确定性;而HPLC-示差折光检测法(RID)具有操作简便，灵敏度高的优点，是常用的方法。
[0003] 在国标及日常糖类检测的液相色谱柱方面，目前较常使用的色谱柱是氨基柱，虽 然氨基柱在糖类分析中有较高的灵敏度和分离度，但是氨基柱连通的HPLC-示差折光检测 器(RID)灵敏度高，系统较难平衡。而且氨基容易水解，当样品通过时，水解产物可以与样品 一同进入检测器检测造成干扰。在长时间的使用过程中，流动相通过氨基柱时氨基基团会 有脱洛，存在噪声；当样品纯度不尚时，噪声也会很大，氣基柱的柱效下降很快。氣基柱的柱 效下降是由氨基本身特性决定的，使用后的常规保养是起不到太大作用的，所以导致氨基 柱的使用寿命较短。
[0004] 同时，目前用于糖类检测的HPLC常采用反相系统，在流动相的选择上，多选择乙腈 和水为流动相，通过乙腈与水不同比例的混合达到分离特定糖类的目的。但是在氨基柱-乙 腈水系统的分析中，随着检测糖类数量的增加，氨基柱的柱效下降，部分糖类不能有效的分 离。为了增大分离度，就需要不断调整乙腈水的比例，但是当有机相乙腈比例增大到一定程 度后，氨基柱有效键合就会被破坏，从而降低柱寿命。
[0005] 鉴于不同国家对糖及糖醇的不同要求和食品标签强制性标准的施行，以及进一步 监督食品生产，预防不法商贩利用糖类添加剂的美味、廉价等优点，达到某种营养指标，对 食品进行非法添加，所以需要对常用糖及糖醇进行检测。为了缩短检测周期，提高工作效 率，需要建立一种食品中多种糖及糖醇的同时检测方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种高速、准确、有效的同时检测含乳制品中多种糖及糖醇 的高效液相色谱分析方法，以大大减轻逐个检测的工作量，提高检测效率，保证产品的质 量。
[0007] 本发明选择Waters Xbridge Amide柱作为HPLC色谱柱，Amide柱是酰胺键合柱， 相对于氨基键合柱的稳定性更高，柱流失减少，与示差折光检测器(RID)结合噪音较小，系 统易平衡，且Amide柱pH耐受性极佳，耐高温，随着柱温的升高，糖及糖类分析分离度明显 增强，在70°C以上单糖分析效果最强，最高耐受温度为90°C，柱效下降慢，且柱子使用寿命 更长。
[0008]本发明选择丙酮、水和三乙胺为流动相，系统为正相系统，结合Waters Xbridge Amide柱，耐酸碱性极佳，耐高温，机器噪音小，系统易平衡，且对糖及糖类分离度高，灵敏 度高，分析效果好，随着检测样品数量的增加，柱效下降慢；当大量检测后为了防止柱效下 降，主要流动相丙酮、水比例不需改变，仅仅调整三乙胺的加入量即可保持柱效，且三乙胺 加入量很小，对色谱柱填充物不会造成影响，色谱柱寿命长。
[0009] 本发明采用的具体技术方案如下： 一种同时检测含乳制品中多种糖及糖醇的方法，所述方法为HPLC-不差折光检测法，其 特征在于所述HPLC的色谱条件为:色谱柱采用酰胺键合柱，流动相为丙酮、水和三乙胺的单 流动相，等度洗脱;柱温为70°C，流速为0.8mL/min，进样量为10yL。
[0010] 上述酰胺键合柱具体型号为Waters Xbridge Amide。
[0011] 上述流动相的组成为:丙酮:水=77:23(V/V)，每1000mL流动相加入0.115-0.345mL 三乙胺；当目标物分离度下降时，在上述范围内适当增加三乙胺的量。
[0012] 本发明具体的检测步骤如下： (1) 糖单标溶液的配制：分别准确称取山梨糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、果糖、葡萄糖、蔗 糖、乳糖配制成标准储备液，待用； (2) 标准工作溶液的配制:分别取上述浓度的标准储备液，配制成标准工作溶液； (3) 样品的制备:取样品5.00-20.00g，加水溶解，再加入沉淀剂混合摇匀，最后加入水 定容至50mL，混勾后，离心机离心6 000 r/min，4°C条件下离心5min，取上清液，用0.22μηι 针头滤膜过滤，滤液供检测； (4) 样品检测:选择液相外标法定量，按照一定浓度配制标准工作溶液，用标准溶液的 浓度和相应单体峰面积信号做工作曲线，根据待测样品中单体的响应峰面积和样品量，利 用公式1进行计算：
式中： X -试样中待测组分的含量(mg/g)， C 一从标准曲线计算得到待测组分的浓度(mg/mL)， VI -试样溶液定容的体积(mL)， m-称取样品的质量(g)。
[0013] 上述步骤(3)中所述的沉淀剂为亚铁氰化钾-乙酸锌、0.5%乙酸、氢氧化钠-硫酸铜 溶液中的一种或多种。
[0014] 所述的亚铁氰化钾-乙酸锌溶液的浓度分别为乙酸锌22wt%，亚铁氰化钾10.6wt%。
[0015] 本发明检测方法可适用于牛奶、糕点、糖果、奶粉等含乳制品。检测结果表明：本发 明检测样品分析谱图基线平稳，保留时间稳定，目标物与干扰物可以完全分离，由于以上基 质涵盖了绝大多数检测样品基质的高糖分，高粘度，高干扰等特点，大量进样后，机器性能 及谱图仍然稳定，且分离度好，没有较大波动，以上表明此方法对样品检测的适用性好，且 抗干扰能力强。
[0016] 本发明的有益效果:建立了多种糖及糖醇山梨糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、果糖、葡萄 糖、蔗糖、乳糖同时检测的液相色谱方法，样品前处理简单，方法快捷，灵敏度高，回收率高， 方法的线性范围宽，相关系数好，检出限低，适用性良好，填补了国内以上糖及糖醇同时检 测的空白，大大提高了工作效率。
【附图说明】
[0017] 图1七种糖及糖醇高效液相色谱图。
[0018] 图2牛奶样品的高效液相色谱图。
[0019]图3糕点样品的高效液相色谱图。
[0020]图4糖果样品的高效液相色谱图。
[0021 ]图5奶粉样品的高效液相色谱图。
[0022] 图6采用全新氨基柱检测的糖类高效液相色谱图。
[0023] 图7采用氨基柱检测100次后糖类的高效液相色谱图。
[0024]图8采用氨基柱检测300次后糖类的高效液相色谱图。
[0025]图9采用酰胺柱和乙腈-水检测糖类的高效液相色谱图。
[0026]图10采用酰胺柱和丙酮-水检测糖类的高效液相色谱图。
[0027]图11采用酰胺柱检测500次后糖类的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0028]下面结合附图和具体实施例，并通过对比例来进一步详细说明本发明。
[0029] 本发明涉及的仪器与设备：1100 HPLC(美国Agilent公司）配示差折光检测器； Waters Xbridge Amide(3 · 5ym，4 · 6*250mm，美国Waters公司）；PL602-S天平（Mettier-Toledo公司）；CR22GIII 离心机（日本HITACHI);移液枪（10--100yL，20-200yL，100-1000yL， 5000yL，Eppendorf公司）；0 · 22口111滤膜(德国Membrana公司）。
[0030] 本发明HPLC的流动相为丙酮、水和三乙胺的单流动相（丙酮：水=77: 23(V/V)，每 1000mL流动相加入0.230mL三乙胺），等度洗脱;柱温为70°C，流速为0.8mL/min，进样量为10 yL〇
[0031 ]本发明涉及的试剂与材料:麦芽糖醇、木糖醇、山梨糖醇、蔗糖、乳糖、果糖、葡萄 糖，纯度均>99%;丙酮(色谱纯）;三乙胺(优级纯）。
[0032] 实施例1:牛奶样品中七种糖及糖醇的检测 ⑴七种糖单标溶液的配制:分别准确称取山梨糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、果糖、葡萄糖、 蔗糖、乳糖配制成标准储备液，其中乳糖的标准储备液浓度均为100 mg · ml/1，木糖醇、果 糖、山梨糖醇、葡萄糖、蔗糖的标准储备液浓度均为150 mg · ml/1，麦芽糖醇的标准储备液浓 度为200 mg · mL-1，待用;标准系列浓度见表1。
[0033] 表1七种糖标准储备液浓度及标准系列溶液浓度
(2)标准工作溶液的配制:木糖醇标准工作溶液60 mg · ml/1:取150 mg · ml/1木糖醇标 准储备液4.OOmL入10mL容量瓶中，加水定容至刻度;果糖标准工作溶液60 mg · ml/1:取150 mg · ml/1果糖标准储备液4.OOmL入10mL容量瓶中，加水定容至刻度；山梨糖醇标准工作溶液 60 mg · mL-S取150 mg · mL-1山梨糖醇标准储备液4.00mL入10mL容量瓶中，加水定容至刻 度；葡萄糖标准工作溶液60 mg · ml/1:取150 mg · ml/1葡萄糖标准储备液4.OOmL入10mL容 量瓶中，加水定容至刻度;蔗糖标准工作溶液60 mg · ml/1:取150 mg · ml/1蔗糖标准储备液 4.00mL入10mL容量瓶中，加水定容至刻度；麦芽糖标准工作溶液50 mg · mL-S取200 mg · ml/1麦芽糖标准储备液2.50mL入10mL容量瓶中，加水定容至刻度；乳糖标准工作溶液50 mg · mL-S取100 mg · mL-1乳糖标准储备液5.00mL入10mL容量瓶中，加水定容至刻度。
[0034] 如下表2所示，七种糖及糖醇的标准曲线线性均在0.98以上，线性较好，线性范围 为0.40-60 mg/mL，最低定量限为0.27-0.50 mg/mL，线性范围比较大，且灵敏度较高。
[0035] 表2七种糖及糖醇曲线方程、相关系数、线性范围及检出限表
(3 )以午奶为检测基质，样品的制备：充分混习样品，取样品10.00-20.00g