其装有30ml制备好的盾纤毛虫培养基，置于18-20 °C恒温培养箱内培养20- 24小时，显微镜下吸取lml培养液进行计数。
[0025] 5.吸取20ml纤毛虫培养液，滴入装有滤纸的漏斗进行过滤;过滤后，用10ml过滤的 灭菌海水反向滴洗滤纸的过滤不问，滴洗液收集至灭菌的离心管中，获得l〇ml虫体收集液 体，并在显微镜下计数，其浓度为3.1 X 102/ml。
[0026]实施例二、SmLTL蛋白对纤毛虫的抑制评估
[0027]所述的SmLTL蛋白由118个氨基酸组成，分子量为13.47KDa，等电点为8.52，其氨基 酸序列如下：
[0028] 1 MHHHHHHNRN SISTDQELRK GEFLMSVNGE FKAIFQDDGN FVIYKWSPIff DTKTCGKNPF
[0029] 61 RVLLQPDNNL VMYDKLSKPV WATGTHSNQA NQRMRLTLTD GGRLVLDKDG GEIWGAGG
[0030] 本实验进行重组制备获得SmLTL蛋白。
[0031 ] 1. SmLTL蛋白对纤毛虫活力的抑制评估方法:轻轻晃动虫体收集液，吸取lml收集 液，转移到EP管中，向EP管中加入不同浓度的LTL蛋白（200、100、50、25、12.5ug/ml)孵育于 28°下，对照组实验无凝集素;在显微镜下，不同的时间点观察不同浓度条件下虫子的存活 和死亡的数量，（3、6、12、24、48h)。每个浓度条件下，有三个重复组，其死亡率取其平均数。 [00 32]如表1所示：随着SmLTL蛋白浓度增加，对盾纤毛虫活力有显著的影响，浓度越大， 死亡率越高。
[0033] 2. SmLTL蛋白与纤毛虫结合活力的评估
[0034] (1)荧光标记蛋白FITC-SmLTL制备将待交联的SmLTL蛋白（浓度lmg/ml)放入交联 反应液透析三次（交联反应液配制方法：7 · 56gNaHC03，1 · 06gNa2C03，7 · 36gNaCl，加水定容 至 1L);将FITC溶于DMS0中，浓度为 lmg/ml;按S: F (SmLTL: FITC) = lmg: 150yg的比例将FITC 缓慢加入于LTL蛋白溶液中，轻轻晃动使其与蛋白混合均匀，暗处4°C反应8h;加入5mol/L的 NH4C1至终浓度50mmol/L，4°C终止反应2h;将交联物在roS中透析四次以上，至透析液清亮； 透析结束后，收SmLTL蛋白按10mg/ml的浓度加入BSA，加20%的硫柳汞至终浓度0.02%，加 入肌氨酸钠终浓度〇. 2%，分装并于-20°C暗处保存。
[0035] (2汗11'(：-511^1^与盾纤毛虫结合：取40〇111的虫体收集液，与标记的？11'(：-1^1^ (100mg/ml)按照1:4的比例稀释，室温孵育过夜;对照组，在上述步骤中加入1M D-甘露糖， 室温孵育过夜;过滤的灭菌海水冲洗三遍，以去除掉多余的凝集素，吸取20μ1混合液置于玻 璃载玻片上，荧光显微镜下观察(波长450-490nm，滤镜515nm) 〇
[0036]结果如图1所不：由图1可见盾纤毛虫体表具有较强的焚光信号，表明SmLTL蛋白与 盾纤毛虫具有结合现象；
[0037]图2为加入D-甘露糖后，FITC-SmLTL蛋白与盾纤毛虫结合现象：由图可示，盾纤毛 虫体表荧光强度降低，原因是由于D-甘露糖与SmLTL具有结合现象，则抑制了 SmLTL蛋白与 盾纤毛虫的结合。
[0038]表1 SmTL对纤毛虫活力抑制分析
【主权项】
1. 一种评估海水鱼类粘液凝集素抑制盾纤毛虫的方法，其特征在于它包括Lily-type lectin蛋白对盾纤毛虫的活力抑制评估和结合评估，Lily-type lectin蛋白简称LTL蛋白； 所述的活力抑制评估:轻轻晃动盾纤毛虫虫体收集液，吸取盾纤毛虫虫体收集液，转移 到EP管中，向EP管中加入不同浓度的LTL蛋白孵育于26-28°C。对照组实验无 LTL蛋白，在显 微镜下，不同的时间点观察不同浓度条件下虫子的存活和死亡的数量，每个浓度条件下，设 置三个重复组，其死亡率取其平均数； 所述的结合评估①荧光标记蛋白FITC-LTL制备：将待交联的LTL蛋白放入交联反应液 透析三次;将FITC溶于DMSO中，浓度为lmg/ml;按蛋白质:FITC= lmg: 150yg的比例将FITC缓 慢加入于LTL蛋白溶液中，轻轻晃动使其与蛋白混合均匀，暗处反应;加入NH4C1溶液至其终 浓度50mmol/L，终止反应;将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮;透析结束后，收 蛋白加入BSA，至BSA的终浓度为10mg/ml，加的硫柳汞溶液至其终浓度0.02% (质量百分 比），加入肌氨酸钠至其终浓度0.2 % (质量百分比）； ②FITC-LTL与盾纤毛虫结合:取盾纤毛虫虫体收集液，与标记的100mg/ml FITC-LTL按 照体积比1:4的比例稀释，混合液室温孵育过夜；混合液过滤并用灭菌海水冲洗三遍，以去 除掉多余的凝集素，吸取冲洗后的混合液置于玻璃载玻片上，荧光显微镜下观察虫体上的 焚光强度，以证明海水鱼类Lily-type lectin蛋白是否与虫体结合。2. 根据权利要求1所述的一种评估海水鱼类粘液凝集素抑制盾纤毛虫的方法，其特征 在于所述的交联反应液的成份及其终浓度为：7.56g/L NaHC03，1.06g/L Na2C03，7.36g/L NaCl〇3. 根据权利要求1 一种评估海水鱼类粘液凝集素抑制盾纤毛虫的方法，其特征在于所 述的荧光显微镜的观察波长450-490nm，滤镜515nm〇
【专利摘要】一种评估海水鱼类粘液凝集素抑制盾纤毛虫的方法，属于水产病害防治技术领域，它包括Lily-type？lectin蛋白对盾纤毛虫的活力抑制评估和结合评估。本发明可以较为简便的对海水鱼类Lily-type？lectin(LTL)蛋白具有抑制盾纤毛虫活力的抑制性进行评估，并通过荧光显微镜清晰的观察到LTL蛋白与盾纤毛虫结合现象。
【IPC分类】G01N33/68
【公开号】CN105675882
【申请号】CN201610076868
【发明人】黄智慧, 马爱军, 夏丹丹, 商晓梅, 曲江波, 杨志
【申请人】中国水产科学研究院黄海水产研究所
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年2月4日