甲卡西酮的检测试剂和方法
【专利摘要】本发明提供检测甲卡西酮及其结构类似物的免疫层析检测卡，所述检测卡包括背衬以及位于背衬上的加样垫、金反应垫、反应膜和吸水纸；其中，所述加样垫用处理液处理。本发明还提供装有所述检测卡的检测试剂盒。本发明的检测卡或检测试剂盒操作简便、价格低廉、适合现场检测、能快速检测待测样品，例如人尿液中的甲卡西酮及其结构类似物，非常适合监督执法部门日常监督中使用并满足基层的监督检验需求。
【专利说明】
甲卡西酬的检测试剂和方法
技术领域
[0001] 本发明设及药物的检测。具体地说，本发明设及甲卡西酬及其结构类似物的检测 试剂、该检测试剂的制备方法W及利用该检测试剂检测甲卡西酬及其结构类似物的方法。
【背景技术】
[0002] 甲卡西酬(Methcathinone)属于卡西酬（化化inone)类策划药（"Designer Drug，'）[i]。运类策划药物包括亚甲二氧化咯戊酬(MDPV)、甲卡西酬(MC)、3,4-亚甲二氧基甲卡西酬 (101〇等[2、3]。1975年，在名为化*113 6山1113化'334的植物中确定有卡西酬成分[4]，下文为 卡西酬类策划药物的母体化合物卡西酬结构式W，其衍生物甲卡西酬在1928年合成，4-甲 基甲卡西酬在1929年合成[2、33。2009年，合成卡西酬及卡西酬类策划药使用明显增多W。 2012年5月26日，美国迈阿密发生"食脸"事件，新型毒品"浴盐"疑为元凶，"浴盐"中最常见 的成分为4-甲基甲卡西酬和/或者亚甲基二氧邮咯化咯戊酬。2010年10月欧盟议会要求成 员国将4-甲基甲卡西酬列为管制药物W。至2014年，共有77种卡西酬类策划药列入了欧洲 药品与毒品成癒监测中屯、化MCDDA)的监管W。中国台湾、加拿大、美国等国家和地区均将4- 甲基甲卡西酬列为管制^。2005年卡西酬、甲卡西酬列入第一类精神药品管理。2010年8月2 日中国国家食品药品监督管理局、公安部、卫生部联合发表公告，决定自2010年9月1日起将 4-甲基甲卡西酬列入第一类精神药品管理，包括4-甲基甲卡西酬及其可能存在的盐、化学 异构体、醋和酸W。
[0003
123 近年来，设及甲卡西酬的案件不断出现。除了上述的"食脸案"W外。在法国、美国 和澳大利亚均发现将甲卡西酬当做"摇头丸"出售。据调查，英国也出现了比较严重的甲卡 西酬滥用问题，滥用者包括不同社会阶层和人群。在中国，也已经破获了设及甲卡西酬的案 件。 2 现有技术对甲卡西酬及其结构类似物的检测主要是通过高效液相色谱-串联质谱 法、高效液相色谱法、生物忍片技术等检测方法进行W-W。但运些技术具有明显的缺陷，例 如，操作复杂、设备昂贵、耗时、不适合现场检测等等。此外，现有技术中对甲卡西酬及其结 构类似物进行检测的方法对仪器设备W及操作人员的要求较高、所需时间较长，从而造成 较高的检测成本。 3 有文献发现，在采用W上实验室仪器方法进行样本检测时，通常需要使用缓冲液， 如PBS对样本进行稀释，运样可W降低原样本的基质效应，降低干扰，提高产品的特异 性。然而，在现场检测时往往无法对样本做稀释处理，样本都是直接加到层析试纸的加 样区，从而造成基质效应十分明显。基于W上原因，在实验室常规方法，如酶联免疫法中所 使用的抗原抗体组合应用在现场检测的层析试纸方法中经常不适用。因此，如果不能显著 降低待测样品的基质效应，进而得到准确和可靠的检测结果会给检测人员，特别是对监督 执法部口的日常监督工作带来诸多不便。
[0007] 综上所述，本领域急需一种操作简便、成本低廉、快速、准确、与试验室仪器方法所 得结果相吻合的、适合现场使用的检测试剂。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种操作简便、成本低廉、快速的、适合现场检测的甲卡西酬 及其结构类似物的检测试剂。
[0009] 本发明的另一目的是提供该检测试剂的制备方法W及利用该检测试剂检测甲卡 西酬及其结构类似物的方法。
[0010] 在第一方面，本发明提供一种检测甲卡西酬及其结构类似物的免疫层析检测卡， 所述检测卡包括背衬W及位于背衬上的加样垫、金反应垫、反应膜和吸液垫；
[0011] 所述金反应垫上包被有甲卡西酬及其结构类似物抗体的胶体金标记物和IgG的胶 体金标记物，所述反应膜上设置有检测线和质控线，所述检测线上包被有甲卡西酬及其结 构类似物抗原，所述质控线上包被有所述IgG的抗体；
[0012] 其中，所述加样垫用处理液处理，所述处理液包含0.19-0.76%的十水合四棚酸 钢、0.12-1.11%棚酸、0.2-0.4%1'讯661120、0.2-0.4%化^〇11乂-100、0.05-0.2%酪蛋白钢 和水，pH 为 8.0-9.0;
[0013] 所述甲卡西剛及其结构类似物如下式所示：
[0014]
[0015] 式中，
[0016] Ri选自：H、C广C3烷基(优选甲基）、面素（优选F);
[0017] R2 选自：H;
[001引 R3选自：H、&-C3烷基（优选甲基或乙基）；
[0019] R4选自：H。
[0020] #且化的生施节古由.祈巧甲卡西酬及其结构类似物如下所示：
[0021]
[0022]其中，
[0024] 在具体的实施方式中，所述处理液包含0.57-0.76%的十水合四棚酸钢、0.12- 0.87%棚酸、0.2-0.3%Tween20、0.2-0.3%化itonX-100、0.05-0.1%酪蛋白钢和水，pH为 9 ? 0 O
[0025] 在优选的实施方式中，所述IgG包括但不限于:兔IgG、马IgG,等等。
[0026] 在优选的实施方式中，所述IgG抗体包括但不限于:羊抗兔IgG、羊抗马IgG,等等。
[0027] 在优选的实施方式中，所述加样垫的处理方式包括但不限于：用所述处理液涂布 所述加样垫、用所述处理液浸溃所述加样垫，等等。
[0028] 在优选的实施方式中，所述加样垫是纤维膜。
[0029] 在优选的实施方式中，所述反应膜是硝酸纤维素膜。
[0030] 在具体的实施方式中，所述甲卡西酬及其结构类似物抗体是下表所示的 Fitzgerald Industries International的甲卡西酬抗体、艾博抗（上海）贸易有限公司的 甲卡西酬抗体、Biorb^ Explore.Bioreagents.的甲卡西酬抗体。
[0031]
123456789 在具体的实施方式中，所述甲卡西酬及其结构类似物抗体是艾博抗(上海)贸易有 限公司的甲卡西酬抗体。 2 在优选的实施方式中，所述免疫层析检测卡对甲卡西酬及其结构类似物的最低检 出量是 lOOOng/ml。 3 在优选的实施方式中，所述免疫层析检测卡还包括卡盒，所述卡盒由下盖和上盖 组成，上盖设有加样窗口和读卡窗口，所述甲卡西酬或其结构类似物的免疫层析检测卡置 于下盖中，所述加样窗口和读卡窗口分别对应于所述甲卡西酬及其结构类似物的免疫层析 检测卡上的加样垫和质控线及检测线。 4 在优选的实施方式中，所述免疫层析检测卡用于检测待测样品，例如人尿液中的 甲卡西酬及其结构类似物。 5 在第二方面，本发明提供一种检测甲卡西酬及其结构类似物的检测试剂盒，所述 检测试剂盒装有： 6 (a)本发明的第一方面所述的免疫层析检测卡;和 7 (b)利用所述检测试剂盒检测甲卡西酬及其结构类似物的使用说明书。 8 在优选的实施方式中，所述检测试剂盒中还可装有用于加样或辅助检测的其它器 件等等。 9 在优选的实施方式中，所述用于加样的器件包括但不限于:一次性滴管。
[0041] 在第=方面，本发明提供一种用于处理检测甲卡西酬及其结构类似物的免疫层析 检测卡的加样垫的处理液，所述处理液包含0.19-0.76%的十水合四棚酸钢、0.12-1.11 % 棚酸、0.2-0.4%1'讯661120、0.2-0.4%时11〇11乂-100、0.05-0.2%酪蛋白钢和水，口出％8.0- 9 ? 0 O
[0042] 在具体的实施方式中，所述处理液包含0.57-0.76%的十水合四棚酸钢、0.12- 0.87%棚酸、0.2-0.3%Tween20、0.2-0.3%化itonX-100、0.05-0.1%酪蛋白钢和水，pH为 9 ? 0 O
[0043] 在第四方面，本发明提供本发明第=方面所述的处理液在制备检测甲卡西酬及其 结构类似物的免疫层析检测卡中的用途。
[0044] 在第五方面，本发明提供一种甲卡西酬及其结构类似物的检测方法，所述方法包 括利用本发明第一方面所述的免疫层析检测卡或本发明第二方面所述的检测试剂盒检测 待测样品中的甲卡西酬及其结构类似物。
[0045] 在优选的实施方式中，所述检测方法是非治疗性或非诊断性的。
[0046] 在第六方面，本发明提供本发明第一方面所述的免疫层析检测卡或本发明第二方 面所述的检测试剂盒在检测甲卡西酬及其结构类似物中的应用。
[0047] 在优选的实施方式中，所述应用是非治疗性或非诊断性的。
[0048] 在第屯方面，本发明提供本发明第一方面所述的免疫层析检测卡的制备方法，所 述方法包括W下步骤：
[0049] 1)采用制备胶体金颗粒；
[0050] 2)用1)中制备的胶体金颗粒分别标记甲卡西酬及其结构类似物抗体、IgG;
[0051] 3)将标记好的免疫胶体金喷在纤维膜上，制备成金反应垫；
[0052] 4)在硝酸纤维素膜上包被甲卡西酬及其结构类似物抗原作为检测线，包被步骤2) 中所述的IgG的抗体作为质控线;和
[0053] 5)依次将加样垫、金反应垫、硝酸纤维素膜和吸水纸黏贴在背衬上，切割成试纸并 装入卡盒。
[0054] 在优选的实施方式中，所述胶体金颗粒采用巧樣酸=钢还原法制备。
[0055] 在优选的实施方式中，所述IgG是兔IgG或者马IgG;所述IgG的抗体是羊抗兔IgG或 者羊抗马IgG。
[0056] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可W互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0057] 图1显示了本发明的甲卡西酬检测试剂的结构示意图。
【具体实施方式】
[0058] 本发明首次提供了一种可应用于现场检测甲卡西酬及其结构类似物的检测试剂。 本发明的技术创新点在于设计了一种加样垫处理方法，该方法显著提高了现有甲卡西酬及 其结构类似物抗体的特异性和灵敏度，克服了现有甲卡西酬及其结构类似物抗体的特异性 和灵敏度不高W及无法应用于实际的现场检测的缺陷，从而能够在不对样本进行稀释的情 况下，保证检测的灵敏度和特异性。本发明的检测试剂所得的检测结果与实验室检测方法 所得的检测结果完全一致，从而提供了一种能够应用于现场检测甲卡西酬及其结构类似物 的检测试剂，并且检测过程迅速、检测结果准确。在此基础上完成了本发明。
[0059] 具体地说，本发明提供了一种操作简便、成本低廉、快速、更适合现场检测的甲卡 西酬及其结构类似物的检测卡和检测试剂盒及其制备方法。本发明的检测试剂盒克服了现 有技术中操作复杂、设备昂贵、耗时、不适合现场检测等缺陷。
[0060] 甲卡西酬及其结构类似物
[0061 ]甲卡西酬是苯丙胺的一种类似物，一般为粉末状态或与水混合液体，吸食或饮用 后有提神作用，与苯丙胺类效果类似。研究表明，该物质能导致急性健康问题和毒品依赖， 过量易造成不可逆的永久脑部损伤甚至死亡。
[0062] 本领域技术人员基于专业知识可W知晓，在甲卡西酬的基础上可W进行各种取代 或衍生，从而获得各种具备新结构的类似物，而运些结构类似物也具有与甲卡西酬相似的 活性。因此，本领域还需要甲卡西酬的检测试剂能够检测甲卡西酬的结构类似物。
[0063] 巧化.立:ir祈冰的田去而刚及其结构类似物并不限于结构如下式所示的化合物：
[0064]
[00化]式中，
[0066] 化选自：H、&-C3烷基(优选甲基）、面素；
[0067] R2选自：H;
[006引 R3选自：H、Ci-C3烷基(优选甲基或乙基）；
[00例 R4选自：H。
[0070]在具体的实施方式中，本发明所述的甲卡西酬及其结构类似物如下式所示：
[0071;
[0072]其中，
[0074] 在优选的实施方式中，本发明所述的甲卡西酬及其结构类似物是甲卡西酬。
[0075] 目前，在现有技术中缺乏对甲卡西酬及其结构类似物进行现场检测的检测试剂。 就甲卡西酬及其结构类似物的现场检测而言，最低检出量应该1000-2000ng/ml，优选地 lOOOng/mlo
[0076] 加样垫处理液
[0077] 如上所述，本发明人出乎意料地发现，利用特定的处理液处理加样垫后，能够显著 提高原本不适用于甲卡西酬或其结构类似物的现场检测的现有甲卡西酬及其结构类似物 抗体的特异性和灵敏度，从而获得能够应用于现场检测并且检测结果准确、可靠的甲卡西 酬及其结构类似物的检测试剂。
[0078] 在具体的实施方式中，本发明的甲卡西酬及其结构类似物的免疫层析检测卡的加 样垫处理液包含0.19-0.76 %的十水合四棚酸钢、0.12-1.11 %棚酸、0.2-0.4%Tween20、 0.2-0.4 % Tr i tonX-100、0.05-0.2 %酪蛋白钢和水，pH为8.0-9.0。优选地，所述处理液包含 0.57-0.76 % 的十水合四棚酸钢、0.12-0.87 % 棚酸、0.2-0.3 % Tween20、0.2-0.3 % Tr i tonX-100、0.05-0.1 % 酪蛋白钢和水，pH为9.0。
[0079] 不想受具体理论的束缚，但发明人相信，用本发明的处理液处理加样垫能够显著 降低待测样品的基质效应，从而获得良好的灵敏度和特异性，进而使得本发明的检测试剂 能够适用于甲卡西酬的现场检测并获得准确、可靠的检测结果。
[0080] 甲卡西酬及其结构类似物的抗体
[0081] 如上所述，在用本发明的处理液处理加样垫后，利用甲卡西酬及其结构类似物的 抗体进行检测的特异性和灵敏度得到显著提高。因此，在了解了本发明技术内容的基础上， 本领域技术人员不难测试各种甲卡西酬及其结构类似物的抗体，从而找到适用于本发明检 测体系的抗体。
[0082] 本文实施例所列举的抗体仅仅代表了实施本发明的优选实例，并不代表本发明仅 限于运些具体的抗体。例如，可用于本发明的甲卡西酬及其结构类似物抗体包括但不限于 下表所示的甲卡西酬抗体： r00831
[0084] 在优选的实施方式中，可用于本发明的甲卡西酬及其结构类似物抗体是艾博抗 (上海)贸易有限公司的甲卡西酬抗体(货号为Abl23953)。
[0085] 甲卡西酬及其结构类似物的免疫层析检测卡
[0086] 在W上出乎意料的发现的基础上，本发明提供一种检测甲卡西酬及其结构类似物 的免疫层析检测卡，所述检测卡包括背衬W及位于背衬上的加样垫、金反应垫、反应膜和吸 水纸；
[0087] 所述金反应垫上包被有甲卡西酬及其结构类似物抗体的胶体金标记物和IgG,所 述反应膜上设置有检测线和质控线，所述检测线上包被有甲卡西酬及其结构类似物抗原， 所述质控线上包被有所述IgG的抗体；
[0088] 所述加样垫用上述处理液处理。
[0089] 在本发明的免疫层析检测卡中，所述IgG和所述IgG的抗体起到质控的作用，表示 某次检测过程(层析过程)是否正常；即，如果所述IgG能够经层析正常到达质控线，质控线 上IgG的抗体与该IgG结合，从而显色；而如果该检测卡已经失效或受损，该IgG无法正常到 达质控线，则无法显色。
[0090] 因此，本领域技术人员可W自行选择用于本发明的IgG。在具体的实施方式中，所 述IgG包括但不限于:兔IgG、马IgG,等等。相应地，本领域技术人员可W自行选择用于本发 明的IgG抗体，只要该IgG抗体是所述IgG的抗体即可。在具体的实施方式中，所述IgG抗体包 括但不限于:羊抗兔IgG、羊抗马IgG,等等。
[0091] 本领域技术人员应该知晓，可W采用各种方式利用本发明的处理液处理加样垫， 包括但不限于：用所述处理液涂布所述加样垫、用所述处理液浸溃所述加样垫，等等。
[0092] 在本发明中，加样垫和反应膜的材质可由技术人员自主选择，例如，加样垫可W是 纤维膜;反应膜可W是硝酸纤维素膜。
[0093] 为保护本发明的免疫层析检测卡W及便于使用和观察检测结果，本发明的所述免 疫层析检测卡还可包括卡盒，所述卡盒由下盖和上盖组成，上盖设有加样窗口和读卡窗口， 所述甲卡西酬或其结构类似物的免疫层析检测卡置于下盖中，所述加样窗口和读卡窗口分 别对应于所述甲卡西酬及其结构类似物的免疫层析检测卡上的加样垫和质控线及检测线。
[0094] 在本发明的甲卡西酬及其结构类似物的免疫层析检测卡的基础上，本发明还提供 一种检测甲卡西酬及其结构类似物的检测试剂盒，所述检测试剂盒装有：
[00M] (a)本发明的免疫层析检测卡;和
[0096] (b)利用所述检测试剂盒检测甲卡西酬及其结构类似物的使用说明书。
[0097] 基于本发明的内容W及本领域的公知常识，本领域技术人员应该了解，本发明的 检测试剂盒中还可W装有用于加样或检测的其它辅助器件。例如，本发明的检测试剂盒中 还可装有加样器件等等。在具体的实施方式中，所述加样器件包括但不限于:一次性滴管。
[0098] 本发明的甲卡西酬及其结构类似物的免疫层析检测卡或检测试剂盒可W快速而 准确地检测待测样品，包括但不限于人尿液中的甲卡西酬及其结构类似物。
[0099] 在本发明的甲卡西酬及其结构类似物的免疫层析检测卡或检测试剂盒的基础上， 本发明进一步提供了利用本发明的免疫层析检测卡或检测试剂盒检测待测样品中的甲卡 西酬及其结构类似物的方法。
[0100] 在优选的实施方式中，所述检测方法是非治疗性或非诊断性的。
[0101] 本发明的免疫层析检测卡可W通过如下所述的方法制备：
[0102] 1)采用制备胶体金颗粒；
[0103] 2)用1)中制备的胶体金颗粒分别标记甲卡西酬及其结构类似物抗体、和IgG;
[0104] 3)将标记好的免疫胶体金喷在纤维膜上，制备成金反应垫；
[0105] 4)在硝酸纤维素膜上包被甲卡西酬及其甲卡西酬结构类似物抗原作为检测线，包 被步骤2)中所述IgG的抗体作为质控线;和
[0106] 5)依次将加样垫、金反应垫、硝酸纤维素膜和吸水纸黏贴在背衬上，切割成试纸并 装入卡盒。
[0107]本发明的胶体金颗粒可W采用本领域技术人员已知的任何合适的方法制备。例 如，本发明的胶体金颗粒可W采用巧樣酸=钢还原法制备。
[010引本发明的优点：
[0109] 1.本发明首次提供了能适合现场检测的、操作简便、成本低廉、快速、结果准确的 甲卡西酬及其结构类似物的免疫层析检测卡和检测试剂盒；
[0110] 2.本发明的甲卡西酬及其结构类似物的免疫层析检测试剂具备良好的特异性，可 W区分甲卡西酬及其结构类似物与其它干扰物质；
[0111] 3.本发明的甲卡西酬及其结构类似物的免疫层析检测试剂具备优异的灵敏度，能 够符合现场检测甲卡西酬及其结构类似物的要求;和
[0112] 4.本发明的甲卡西酬及其结构类似物的免疫层析检测试剂对各种甲卡西酬结构 类似物具有普遍适用性；
[0113] 5.本发明的检测试剂降低了影响免疫层析方法结果的样本基质效应，保证了现场 检测结果的特异性和灵敏度；
[0114] 6.利用本发明的检测试剂无需对样品作额外的稀释;和
[0115] 7.本发明的检测试剂获得的检测结果与试验室仪器方法所得结果高度吻合。
[0116] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，或本领域已知的文献，例如各种教科书中所述的条件，或市售可得仪器或试剂的使用说 明书，或按照制造厂商所建议的条件。
[0117] 材料与方法：
[0118] 材料；
[0119] 本发明所用的各种试剂购自国药集团化学试剂有限公司，Sigma,Amresco,和光 纯药工业株式会社(WAKO);
[0120] 单克隆抗体和抗原购自： Lm 22」万法；
[0123] 本发明方法具体可包括如下步骤：
[0124] (1)胶体金溶液制备
[01巧]量取纯化水400-500ml，将1-2%氯化金4-5ml，倒入S角烧瓶（内置磁力揽拌子）， 加热拌器，待溶液完全沸腾;将1-2%巧樣酸S钢5-6ml-次快速倒入沸腾的溶液中，溶液颜 色由黄色变为黑色并逐渐转变为红色，关闭加热电源，停止加热，冷却至室溫，即0.01%- 0.02 %胶体金，室溫保存。
[0126] (2)胶体金标记物的制备
[0127]将步骤（I)中的胶体金50ml，用适量碳酸钟溶液边揽拌边调至抑=7.5-9.0，加入 0.5-lmg甲卡西酬抗体或者甲卡西酬结构类似物抗体，400-800;r/min揽拌，反应30-40min; 再加入 2-3ml 胶体金体积的 10%-12%BSA 溶液，400-800r/min 揽拌，8500-10000r/min 离屯、， 弃上清，用金标记物稀释液收集沉淀，制备成甲卡西酬抗体或者甲卡西酬结构类似物抗体 胶体金标记物。
[01 %]将步骤（1)中的胶体金50ml，用适量碳酸钟溶液边揽拌边调至抑=7.5-9.0，加入 0.5-lmg兔IgG或者马IgG，400-800r/min揽拌，反应30-40min;再加入2-3ml胶体金体积的 10 % -12 % BSA溶液，400-800r/min揽拌，8500-10000r/min离屯、，弃上清，用金标记物稀释液 收集沉淀，制备成兔IgG或者马IgG胶体金标记物。
[0129] (3)金反应垫的制备
[0130] 将步骤(2)的甲卡西酬抗体或者甲卡西酬结构类似物抗体胶体金标记物和兔IgG 或者马IgG胶体金标记物按1:1的比例混合，用喷金仪W 2-lOiil/cm的浓度均匀喷在纤维膜 上，真空抽干，制成金反应垫。
[0131] (4)反应膜的制备
[0132] 将羊抗兔IgG或者羊抗马IgG稀释成0.5-1.Omg/ml，甲卡西酬抗原或者甲卡西酬 结构类似物抗原稀释成0.5-2mg/ml，用划膜仪W1-化Vcm的浓度包被在硝酸纤维素膜上， 制备成反应膜，真空抽干。
[0133] (5)加样垫的制备
[0134] 称量十水合四棚酸钢5.721-7.628g、棚酸1.237-8.659g，加入到适量的纯化水中， 揽拌至完全溶解;再分别称取2-3旨、2-3旨、0.5-1旨的1^661120、化1*〇11乂-100、酪蛋白钢，加 入到上述溶液中，使其终浓度分别为0.2%-0.3%、0.2%-0.3%、0.05%-0.1%，揽拌至完 全溶解，调节pH至8.0-9.0,用纯化水定容至1000ml。将上述溶液按照比例(40ml/张)涂布在 纤维膜上，室溫自然惊干，然后真空抽干。
[0135] (6)试剂组装：
[0136] 将加样垫、金反应垫、反应膜、吸水纸，按照顺序(如图1所示)粘贴在背衬上，组装 完成后，切割成一定宽度的试纸条，再将试纸条安装在卡盒中。
[0137] 下文结合具体实施例对本发明说明如下：
[013引实施例1
[0139] 取胶体金50ml，用适量碳酸钟溶液边揽拌边调至抑=8.5，加入0.5mg甲卡西酬抗 体(艾博抗(上海）贸易有限公司，Abl23953)，800r/min揽拌，反应30min;再加入2ml胶体金 体积的10 % BSA溶液，SOOr/min揽拌，850化/min离屯、，弃上清，用金标记物稀释液收集沉淀， 制备成甲卡西酬抗体胶体金标记物。
[0140] 取胶体金50ml，用适量碳酸钟溶液边揽拌边调至抑=8.5,加入0.5mg兔IgG，800r/ min揽拌，反应30min;再加入2ml胶体金体积的10 % BSA溶液，SOOr/min揽拌，SSOOr/min离 屯、，弃上清，用金标记物稀释液收集沉淀，制备成兔IgG胶体金标记物。
[0141] 按照比例（1:1)将甲卡西酬抗体金标记物和兔IgG金标记物混合，喷至纤维膜上， 真空抽干制成金反应垫，备用。
[0142] 实施例2
[0143] 称量十水合四棚酸钢7.628g、棚酸1.237g，加入到适量的纯化水中，揽拌至完全溶 解;再分别称取2邑、2邑、0.5邑的1^661120、化^〇诚-100、酪蛋白钢，加入到上述溶液中，使其终 浓度为0.2%、0.2%、0.05%，揽拌至完全溶解，调节pH至9.0，用纯化水定容至1000 ml，得到 加样垫处理液。将上述缓冲液按照比例涂布在纤维膜上，室溫自然惊干，真空抽干，制备成 加样垫。
[0144] 实施例3.最低检出量的确定
[0145] 本实施例参照《药物滥用检测试剂技术审查指导原则》中关于检测阔值(CUT-OFF， 或最低检出量)的确定方法对本发明的检测试剂的最低检出量进行验证和确定。
[0146] 将高于和低于最低检出量(CUT-0FF=1000ng/ml)的25%和50%的样品（500ng/ ml，750ng/ml，1250ng/ml，1500ng/ml浓度的甲卡西酬），每个浓度分装成18份，编制盲码，分 别由3个操作者进行检测，每个操作者共24份样品。操作者将样品滴加到试剂的加样孔，液 体向前层析与固定在检测线和质控线上物质发生结合而显色。5min后，质控线清晰可见，说 明检测过程正常;低于最低检出量的浓度，检测线出现紫红色，结果为阴性;高于最低检出 量的浓度，检测线无紫红色，结果为阳性。
[0147] 本发明的检测试剂的检测结果如下所示：
[014 引
[0149] 根据W上结果，并结合药物滥用检测试剂技术审查指导原则对阔值的判断方法， 本发明的检测试剂的最低检出量经验证为1 OOOng/ml。
[0150] 因此，本发明的检测试剂能够适合甲卡西酬的现场检测。
[0151] 实施例4.临床样本检测
[0152] 本发明人利用本发明的甲卡西酬检测试剂检测了54份临床样本（山西省长治市）， 19份高于巧0 % CUT-OFF值，1份在CUT-OFF值至巧0 % CUT-OFF值，检测结果均为阳性；1份在- 50 % CUT-OFF值至CUT-OFF值，33份低于-50 % CUT-OFF值，检测结果均为阴性。
[0153] 利用本发明的甲卡西酬检测试剂得到的检测结果与参考方法LC-MS/MS的符合率 为100%。检测结果如表1所示。
[0154] 表1.甲卡西酬试剂与参考方法比对结果
[0155]
[0156] 讨论；
[0157] 本发明人欣喜地发现，利用本发明的甲卡西酬检测试剂得到的检测结果与实验室 标准方法得到结果完全一致；
[0158] 此外，利用本发明的甲卡西酬检测试剂将操作时间从实验室标准方法所需的数小 时缩短为约5分钟，从而显著降低了检测所需时间。
[0159] 因此，本发明成功解决了甲卡西酬或其结构类似物的现场检测无试剂可用的缺 陷，在本领域中首次提供了一种用于甲卡西酬或其结构类似物的现场检测的可靠试剂，利 用本发明的甲卡西酬检测试剂得到的检测结果准确，与实验室标准方法得到结果高度吻 厶 1=1 O
[0160] 实施例5.特异性
[0161] 进行特异性研究主要包括物质的交叉干扰。制备样品，分别滴加到试剂的加样孔， 5min后，质控线清晰可见;表2中物质在小于或等于表中所示浓度时，不引起交叉反应。
[0162] 表2.特异性
[0163；
[0164]
[01化]实施例6.
[0166] 本发明人利用其它单克隆抗体化itzgerald Industries InternationaLRandox Laboratories Ltd.、Biorb^ Ewlore.Bioreagents.的甲卡西酬抗体)重复了实施例 1-3。 结果如下表所示：
[0167]
[0168] 从上表可W看出，Randox Laboratories Ltd.的甲卡西酬抗体制备的检测试剂在 进行检测时，检测线在全部浓度都无色带，即，甲卡西酬抗体金标记物与硝酸纤维素膜上包 被的甲卡西酬抗原不结合，因此该抗体不适合利用层析试纸的甲卡西酬现场检测。
[0169] 而Fitzgerald Industries InternationaKBiorbyt Explore. Bioreagents.的 单克隆抗体制备的检测试剂在CUTOFF附近的四个浓度均为阴性，证明运些抗体在制成本 发明的检测试剂后能够与抗原正常结合，但它们的灵敏度相对于艾博抗的抗体略低。
[0170] 实施例7.
[0171] 本发明人进一步检测了在未采用处理液处理加样垫W及用下述处理液1和处理液 2处理加样垫的情况下，利用实施例1和6中的单克隆抗体制备的检测试剂的检测效果。
[0172] 处理液1:称量化出P04.2H20 6.084g、化抽P04.12出0 21.838g加入到适量的纯化水 中，揽拌至完全溶解;再分别称取2邑、2邑、0.5邑的1^661120、化^〇诚-100、酪蛋白钢，加入到上 述溶液中，使其终浓度为0.2%、0.2%、0.05%，揽拌至完全溶解，调节pH至7.0。
[0173] 处理液2:称量=径甲基氨基甲烧(Tris)6.57g加入到适量纯化水中，揽拌至完全 溶解;再分别称取2gTween20、2g PVPlO、2g BSA，加入到上述溶液中，使其终浓度为0.2%、 0.2 %、0.2 %，揽拌至完全溶解，调节抑至8.0。
[0174] 曰 主 二
[0175]
[0176] 从上表结果可W看出，不用处理液处理加样垫，或用处理液1和处理液2处理加样 垫，Fitzgerald Industries International、Biorbyt Explore .Bioreagents和艾博抗（上 海)贸易有限公司的单克隆抗体制备的检测试剂在全部四个浓度都获得阴性的结果，即，均 获得假阴性结果。而Randox Laboratories Ltd.的单克隆抗体制备的检测试剂在检测时， 结果仍然是检测线在全部浓度都无色带，即，卡西酬抗体金标记物与硝酸纤维素膜上包被 的甲卡西酬抗原不结合。
[0177] 讨论；
[0178] 本实施例的结果证明，在不结合本发明处理液的检测体系中，各种单克隆抗体均 无法应用于甲卡西酬的现场检测，或者无法获得可靠的检测结果。不想受具体理论的束缚， 但本发明人相信，本发明的处理液能够显著降低待测样品的基质效应，从而使得抗体能与 抗原正常结合并且具备良好的灵敏度和特异性，进而使得本发明的检测试剂能够适用于甲 卡西酬的现场检测。
[0179] 实施例8.检测不同的甲卡西酬类似物
[0180] 本发明进一步测试了本发明的检测试剂(抗体来自艾博抗(上海）贸易有限公司， AM23953)对不同甲卡西酬类似物的检测效果。对结构类似物从高浓度到低浓度进行梯度 稀释，直至检测结果出现阴性为止，具体数据如下表所示：
LUIGZ」 >人王衣巧未p」有出，伞灰巧护」1 兀趣化1伞削街Wf盛测机^」Wiug/miUUUUng/mi； 的甲卡西酬结构类似物均能检出。
[0183] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 W对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样藩于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
[0184] 参考文献
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【主权项】
1. 一种检测甲卡西酮及其结构类似物的免疫层析检测卡，所述检测卡包括背衬以及位 于背衬上的加样垫、金反应垫、反应膜和吸水纸； 所述金反应垫上包被有甲卡西酮及其结构类似物抗体的胶体金标记物和IgG的胶体金 标记物，所述反应膜上设置有检测线和质控线，所述检测线上包被有甲卡西酮及其结构类 似物抗原，所述质控线上包被有所述IgG的抗体； 其特征在于，所述加样垫用处理液处理，所述处理液包含0.19-0.76%的十水合四硼酸 钠、0.12-1.11%硼酸、0.2-0.4%丁界661120、0.2-0.4%1^切1^-100、0.05-0.2%酪蛋白钠和 水，pH 为 8.0-9.0; 所述甲卡西酮及其结构类似物如下式所示： 式中，R!选自：Η、&-C3烷基(优选甲基）、卤素(优选F); R2选自：Η; R3选自：HA-C3烷基(优选甲基或乙基）； R4选自：Η。2. 如权利要求1所述的免疫层析检测卡，其特征在于，所述甲卡西酮及其结构类似物如 下所示：^3.如权利要求1所述的免疫层析检测卡，其特征在于，所述处理液包含0.57-0.76 %的 十水合四硼酸钠、0 · 12-0 · 87 % 硼酸、0 · 2-0 · 3 % Tween20、0 · 2-0 · 3 % TritonX-100、0 · Οδ?. 1 % 酪蛋白钠和水， pH为9.0 。4.如权利要求1-3中任一项所述的免疫层析检测卡，其特征在于，所述甲卡西酮及其结 构类似物抗体是下表所示的甲卡西酮抗体。5. 如权利要求4所述的免疫层析检测卡，其特征在于，所述甲卡西酮及其结构类似物抗 体是艾博抗(上海)贸易有限公司的甲卡西酮抗体。6. -种检测甲卡西酮及其结构类似物的检测试剂盒，所述检测试剂盒装有： (a) 权利要求1-5中任一项所述的免疫层析检测卡;和 (b) 利用所述检测试剂盒检测甲卡西酮及其结构类似物的使用说明书。7. -种用于处理检测甲卡西酮及其结构类似物的免疫层析检测卡的加样垫的处理液， 所述处理液包含0.19-0.76 %的十水合四硼酸钠、0.12-1.11 %硼酸、0.2-0.4%Tween20、 0 · 2-0 · 4 % Tr i tonX-100、0 · 05-0 · 2 % 酪蛋白钠和水，pH为 8 · 0-9 · 0 〇8. 如权利要求7所述的处理液，其特征在于，所述处理液包含0.57-0.76 %的十水合四 硼酸钠、0.12-0 · 87%硼酸、0.2-0.3%Tween20、0.2-0.3%TritonX-100、0.05-0.1 %酪蛋白 钠和水，pH为9.0。9. 权利要求7或8所述的处理液在制备检测甲卡西酮及其结构类似物的免疫层析检测 卡中的用途。10. -种甲卡西酮及其结构类似物的检测方法，所述方法包括利用权利要求1-5中任一 项所述的免疫层析检测卡或权利要求6所述的检测试剂盒检测待测样品中的甲卡西酮及其 结构类似物。11. 权利要求1-5中任一项所述的免疫层析检测卡或权利要求6所述的检测试剂盒在检 测甲卡西酮及其结构类似物中的应用。12. 如权利要求1-5中任一项所述的免疫层析检测卡的制备方法，所述方法包括以下步 骤： 1) 采用制备胶体金颗粒； 2) 用1)中制备的胶体金颗粒分别标记甲卡西酮及其结构类似物抗体、IgG; 3) 将标记好的免疫胶体金喷在纤维膜上，制备成金反应垫； 4) 在硝酸纤维素膜上包被甲卡西酮及其结构类似物抗原作为检测线，包被步骤2)中所 述的I gG的抗体作为质控线;和 5) 依次将加样垫、金反应垫、硝酸纤维素膜和吸水纸黏贴在背衬上，切割成试纸并装入 卡盒。
【文档编号】G01N33/94GK105954511SQ201610265673
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】金巍, 李基 , 张新燕, 郑强峰, 黄芳芳, 张卫国, 陈捷, 刘培培
【申请人】上海科华生物工程股份有限公司, 公安部禁毒情报技术中心