本发明涉及一株分泌3,4－亚甲基二氧甲基苯丙胺单抗的杂交瘤细胞株zy-2g5-3及其应用，涉及摇头丸单克隆抗体的制备方法，以及尿样中3,4－亚甲基二氧甲基苯丙胺（mdma）的间接竞争酶联免疫检测方法的测定，属于免疫检测技术领域。
背景技术：
摇头丸是新型人工合成毒品的一种，一般以mdma（3,4－亚甲基二氧甲基苯丙胺）、mda（4,5－亚甲基二氧基苯丙胺）、am（苯丙胺）及mam（甲基苯丙胺）为主要有效成分。摇头丸同阿片类毒品一样，具有很强的精神依赖性，不论用何种方法脱毒，半年内复吸率仍高达95%以上。
在毒品的检测中，国内外主要采用免疫层析法，酶联免疫吸附法(elisa)，pcr，放射性免疫等方法对尿液、血液、组织以及毛发等样本进行检测。
技术实现要素：
本发明的目的在于制备一种能够特异性分泌mdma单克隆抗体的细胞株，建立检测mdma的免疫学检测方法。
本发明的技术方案：一株能特异性分泌3,4－亚甲基二氧甲基苯丙胺（mdma）单克隆抗体的杂交瘤细胞株zy-2g5-3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，保藏编号为cgmccno.13090。
提供的mdma杂交瘤细胞株zy-2g5-3的制备方法，采用mdma与牛血清白蛋白（bsa）的偶联物mdma-bsa作为免疫原，与弗氏佐剂混合均匀后，通过皮下注射免疫balb/c小鼠；用mdma与鸡蛋清白蛋白（ova）的偶联物mdma-ova作为包被抗原，运用间接竞争酶联免疫检测法（ic-elisa）对小鼠血清和细胞上清进行筛选。将免疫小鼠的脾细胞通过peg方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接elisa和间接竞争elisa筛选和三次亚克隆，得到一株能特异性分泌mdma抗体的杂交瘤细胞株zy-2g5-3。基本步骤为：
（1）动物免疫与效价测定：采用mdma与牛血清白蛋白（bsa）的偶联物mdma-bsa作为免疫原，采用小剂量短周期方案免疫健康balb/c小鼠，首次免疫用100μg偶联抗原与等量弗氏完全佐剂混匀后进行皮下注射，间隔3周后，再用100μg偶联抗原与等量弗氏不完全佐剂加强免疫，此后每隔3周用半量偶联抗原加强免疫一次；冲刺免疫剂量减半，与等体积的生理盐水混合后采用腹腔免疫。用mdma与鸡蛋清白蛋白（ova）的偶联物mdma-ova作为包被抗原，通过间接竞争elisa检测血清效价和抑制；
其具体elisa程序如下：
1)包被：将包被抗原用0.05mph9.6碳酸盐缓冲液梯度稀释，100μl/孔，37℃孵育2h。
2)洗涤：将板内溶液倾去，每孔注入200μlpbst溶液，置于摇床上振荡3min，甩干，洗涤3次。以下洗涤方法相同。
3)封闭：拍干后，加入200μl/孔封闭液，37℃孵育2h。洗涤后烘干备用。
4)加样：酶标板上半部分加入阴性尿样，50μl/孔（上半部分称为0标），下半部分加入不同浓度的用阴性尿样稀释的mdma标准品，将抗血清从1︰1000开始梯度稀释，50μl/孔（下半部分称为加标），上下部分对应加入不同稀释梯度包被抗原的孔中，37℃孵育30min；充分洗涤后，加入1︰3000稀释的鼠二抗，100μl/孔，37℃孵育30min，洗涤后拍干。
5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μl的显色液（tmb与底物液体积比例1︰5），37℃避光反应15min。
6)终止和测定：取出酶标板，每孔加入50μl终止液（2mol/l的硫酸）终止反应，然后用酶标仪测定各孔的吸光值od450。
7)结果判读：以od450值大于或等于阴性血清对照孔的2.1倍（即p/n≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的elisa效价。上下部分对照，加标od450值为0标一半的即是所加的标准品浓度。
（2）细胞融合与筛选：在冲击免疫三天后，按照常规peg（聚乙二醇，分子量为1450）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；
b、收集sp2/0细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、将脾细胞和sp2/0细胞按照10︰1（数量比）的比例混合，离心后用50%peg融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入rpmi-1640基础培养液，离心后悬浮于含20%胎牛血清、2%的50×hat的rpmi-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5%co2的培养箱中培养。在细胞融合的第三天对融合细胞进行rpmi-1640筛选培养液半换液，第6天进行用含20%胎牛血清、1%的100×ht的rpmi-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选。
筛选分两步：第一步先用间接elisa筛选出阳性细胞孔，第二步选用含mdma的尿样标准品，用间接竞争elisa对阳性细胞进行抑制效果测定。选出对mdma具有较好抑制的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，即可得到能稳定分泌mdma单克隆抗体的细胞株。
（3）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
生物材料样品保藏：一株能特异性分泌3,4－亚甲基二氧甲基苯丙胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株zy-2g5-3，分类命名为单克隆细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2016年10月31日，保藏编号为cgmccno.13090。
本发明的有益效果：本发明获得了能够分泌mdma单克隆抗体且耐受尿样基质的杂交瘤细胞株zy-2g5-3，其在小鼠血清筛选和细胞株筛选中均采用尿样基质，已得到可以耐受尿样基质，且特异性识别3,4－亚甲基二氧甲基苯丙胺的单克隆抗体，用于尿样中3,4－亚甲基二氧甲基苯丙胺的检测，可以满足目前市场上对尿液中mdma免疫检测产品的需求。
附图说明
图1该单克隆抗体在尿样基质中的标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，hat选择性培养基培养，通过间接elisa和间接竞争elisa筛选细胞上清，采用阴性尿样作为基质，最终得到了具有较好灵敏度且耐受尿样的mdma单克隆抗体。
实施例1mdma单克隆抗体的制备
1、动物免疫：采用mdma与牛血清白蛋白（bsa）的偶联物mdma-bsa作为免疫原，选择健康的6～8周龄的balb/c小鼠进行免疫。取免疫原与等体积弗氏完全佐剂混合均匀后，通过皮下注射免疫balb/c小鼠，每只100μg；每间隔21天，采用免疫原与等体积弗氏不完全佐剂进行加强免疫，三免后7～10天采血，使用间接竞争elisa方法测定小鼠血清效价和抑制，选择抑制最好的小鼠，在四免后21天冲击免疫，不使用佐剂，腹腔注射。用mdma与鸡蛋清白蛋白（ova）的偶联物mdma-ova作为包被抗原，通过间接竞争elisa检测血清效价和抑制；
其具体elisa程序如下：
1)包被：将包被抗原用0.05mph9.6碳酸盐缓冲液梯度稀释，100μl/孔，37℃孵育2h。
2)洗涤：将板内溶液倾去，每孔注入200μlpbst溶液，置于摇床上振荡3min，甩干，洗洗涤3次。以下洗涤方法相同。
3)封闭：拍干后，加入200μl/孔封闭液，37℃孵育2h。洗涤后烘干备用。
4)加样：酶标板上半部分加入阴性尿样，50μl/孔（上半部分称为0标），下半部分加入不同浓度的用阴性尿样稀释的mdma标准品，将抗血清从1︰1000开始梯度稀释，50μl/孔（下半部分称为加标），上下部分对应加入不同稀释梯度包被抗原的孔中，37℃孵育30min；充分洗涤后，加入1︰3000稀释的鼠二抗，100μl/孔，37℃孵育30min，洗涤后拍干。
5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μl的显色液（tmb与底物液体积比例1︰5），37℃避光反应15min。
6)终止和测定：取出酶标板，每孔加入50μl终止液（2mol/l的硫酸）终止反应，然后用酶标仪测定各孔的吸光值od450。
7)结果判读：以od450值大于或等于阴性血清对照孔的2.1倍（即p/n≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的elisa效价。上下部分对照，加标od450值为0标一半的即是所加的标准品浓度。
2、细胞融合：在冲击免疫三天后，按照常规peg（聚乙二醇，分子量为1450）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
（1）无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；
（2）收集sp2/0细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；
（3）将脾细胞和sp2/0细胞按照10︰1（数量比）的比例混合，离心后用50%peg融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入rpmi-1640基础培养液，离心后悬浮于含20%胎牛血清、2%的50×hat的rpmi-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5%co2的培养箱中培养。
3、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第三天对融合细胞进行rpmi-1640筛选培养液半换液，第6天进行用含20%胎牛血清、1%的100×ht的rpmi-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选。
筛选分两步：第一步先用间接elisa筛选出阳性细胞孔，第二步选用含mdma的尿样为标准品，用间接竞争elisa对阳性细胞进行抑制效果测定。选出对mdma具有较好抑制的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，即可得到能稳定分泌mdma单克隆抗体的细胞株。
4、单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
使用间接竞争elisa和间接elisa，测定单克隆抗体对mdma的半数抑制率ic50为1.96ng/ml；可以用于尿样中mdma的检测。
该单克隆抗体在尿样基质中的标准曲线如图1所示。
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明专利申请范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。