利用磺酸基石墨烯量子点细胞核靶向特性在检测原位肝癌组织细胞中的应用的制作方法

本发明涉及一种利用磺酸基石墨烯量子点细胞核靶向特性在检测原位肝癌组织细胞中的应用。

背景技术：

肝癌，是临床上最常见的恶性肿瘤之一，其形态分为结节型、巨块型和弥漫型。为达到良好治疗效果，对肿瘤的精确定位显得尤为重要。目前，在肿瘤治疗领域，许多研究者皆致力于研究高性能材料作为示踪剂，利用肿瘤组织特异性的特征，将肿瘤组织与正常组织精确区分开，判定预后及选择适当治疗方案，从而提高后续肿瘤治疗的效果，具有重要临床应用价值。

目前，研究较多的肿瘤示踪剂就是利用肿瘤乏氧、缺血等这些特征，采用如硝基咪唑类化合物等能选择性聚集于乏氧缺血组织的材料，连接放射性核素，用以肿瘤乏氧显像，从而提高肿瘤放射治疗及化疗治疗效果。除此以外，鲜少有材料可广泛应用于大范围普遍的肿瘤检测。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用磺酸基石墨烯量子点细胞核靶向特性在检测原位肝癌组织细胞，正常组织细胞及癌旁组织细胞中的应用｡

本发明采用的磺酸基石墨烯量子点(gqds)是一种高性能荧光材料，磺酸基石墨烯量子点(gqds)可以特异性靶向肿瘤细胞核，从而区分肿瘤组织、癌旁组织与正常组织。制备方法详见中国专利：201510394852.8，磺酸基石墨烯量子点生物荧光探针及其应用。无法穿透正常组织细胞膜；而在肿瘤组织内，gqds容易透过细胞膜，靶向标记肿瘤细胞核。我们在原位肝癌模型中发现，gqds大量聚集在肿瘤组织，此外切片观察发现gqds可以准确区分癌变组织以及正常组织，且界面明显。适用于非侵袭性肿瘤显像定位，有利于后续肿瘤诊断及治疗。

在原位肝癌模型中高效靶向肝肿瘤组织细胞

研究gqds对肿瘤组织特异性靶向能力，通过建立小鼠原位肝癌模型，按30-200mg/kg将磺酸基石墨烯量子点注射入肝癌模型，0.5h后，切片观察gqds在肿瘤组织内分布，体内立即特异靶向肝组织上的肿瘤部位，极少量存在于其他正常组织，并且96h后大部分从体内代谢出来，在体内低毒。

可以精确识别肿瘤组织与癌旁组织界面

gqds在动物肝癌模型内体现非常敏感的压力响应，可作为探针实现肝癌原位精确检测。将gqds(30-200mg/kg)静脉注射入原位肝癌动物模型以及原位注射离体肝癌人体模型，0.5h后，观察切片发现gqds特异靶向肿瘤组织，并高效标记肿瘤组织细胞核。肿瘤组织以及癌旁组织的界面清晰，可清晰观察到在密集的肿瘤组织，gqds特异性靶向肿瘤细胞核，而在分布松散的癌旁组织内，gqds在正常肝组织间质内分散分布。对人离体肝癌模型和动物肝癌模型识别能力皆良好。

可以精确区分肿瘤组织细胞，正常组织细胞及其癌旁组织细胞，可以实现早期肿瘤检测

此外，将gqds(30-200mg/kg)静脉注射入不同体积原位肝癌动物模型内，0.5h后，检测不同体积肝癌组织内，肿瘤、癌旁和肝组织内gqds分布情况。发现gqds在肝癌组织内的聚集也与肿瘤体积正相关，说明gqds特异性区分肿瘤组织性能良好。且观察切片发现中，肿瘤体积>66mm³时，gqds特异性聚集肿瘤细胞核，在癌旁组织也能靶向零星存在的肿瘤细胞核，而不能进入正常组织细胞核，说明gqds可以精确区分肿瘤、癌旁及正常组织；肿瘤体积在66mm³时，相当于肿瘤长宽为5mm，即可高效灵敏地检测肿瘤。验证了gqds也可以作为探针进行肝癌的早期检测。

本发明方法的优点和特点如下所述:

(1)gqds对肝肿瘤细胞核特异性靶向，精确区分正常肝组织及癌旁组织。进行标记识别的方法简单，低毒，高荧光强度，不需要对材料进行二次修饰｡

(2)gqds能实现高效、灵敏的早期肿瘤检测｡

(3)操作简单、反应灵敏、效果明显。

附图说明

图1磺酸基石墨烯量子点(gqds)在小鼠原位肝癌模型脏器内分布。a：静脉注射0.5h及96h后，动物模型不同脏器内gqds分布情况。b：gqds脏器内荧光强度信号统计。

图2gqds在人体肝癌模型及小鼠肝癌模型中界面分布情况；a：gqds原位注射0.5h后，在两个不同肿瘤体积人体肝癌样本中，检测分布情况，可以高效识别肿瘤及癌旁组织。b：gqds原位注射0.5h后，在两个不同肿瘤小鼠肝癌样本中，检测分布情况，可以高效识别肿瘤及癌旁组织。标尺：10µm。

图3gqds原位高效识别肝癌与正常肝组织；静脉注射gqds0.5h后，检测gdqs在不同肿瘤体积的小鼠原位肝癌样本内，在肿瘤、癌旁、正常肝内分布情况差异。标尺：10µm。

图4小鼠原位肝癌模型内，肿瘤体积和gqds分布情况的关系。小鼠原位肝癌模型内，肿瘤体积与gqds在肝内分布情况。a：gqds静脉注射进入小鼠原位肝癌模型后，肿瘤内信号分布与肿瘤体积的关系；b：gqds尾静脉注射进入小鼠原位肝癌模型后，肝内信号分布与肿瘤体积的关系。

具体实施方式

现将本发明的具体实施例叙述于后｡原位肝癌模型的简历方法请参见：[1]

实施例1：gqds在原位肝癌模型中高效靶向肝肿瘤组织细胞：

gqds对肿瘤特异性靶向能力的实验，通过建立小鼠原位肝癌模型，每隔一天将gqds(30-200mg/kg)静脉注射入动物模型，0.5h，96h后，取出心、肝+肿瘤、脾、肺、肾、脑，置于活体成像观察脏器内gqds荧光强度，并对荧光强度进行统计。研究表明压力响应gqds对肿瘤组织具有特异性靶向能力，0.5h后，体内立即特异靶向肝组织上的肿瘤部位，极少量存在于其他正常组织，并且96h后大部分从体内代谢出来，在体内低毒。具体结果参见图1。

实施例2：gqds可以精确识别肿瘤组织与癌旁组织界面

gqds对肿瘤特异性靶向能力的实验，通过动物原位肝癌模型以及人体肝癌模型，将gqds(30-200mg/kg)静脉注射入动物模型或原位注射进入人体肝癌模型，0.5h后，切片观察gqds在肿瘤组织内分布。我们找到肿瘤组织以及癌旁组织的界面部位，可清晰观察到在密集的肿瘤组织，gqds特异性靶向肿瘤细胞核，而在分布松散的癌旁组织内，gqds在正常肝组织间质内分散分布，且零星存在于少量肿瘤细胞核内。表明gdqs可以高效地将肿瘤组织与其他组织特异性区分开来，适用于临床研究。具体结果参见图2。

实施例3：gqds可以精确区分肿瘤组织细胞，正常组织细胞及其癌旁组织细胞，可以实现早期肿瘤检测：

gqds在动物肝癌模型内体现非常敏感的肿瘤体积响应，可作为探针实现肝癌原位精确检测识别。为研究肿瘤大小与gqds在肿瘤内聚集的关系，我们将不同体积肝癌肿瘤组织、癌旁组织以及正常组织取出后，组织样品制成20µm厚的冷冻切片样品，用于进行激光共聚焦显微镜观察gqds在肿瘤组织以及正常肝组织内分布情况。检测发现肿瘤、癌旁组织及正常组织内gqds的分布情况与肿瘤体积有关，且gqds在肝癌组织内的聚集与肿瘤体积正相关，说明gqds特异性区分肿瘤组织性能良好。且观察切片发现中，肿瘤体积>66mm³时，相当于肿瘤长宽为5mm，gqds特异性聚集肿瘤细胞核，在癌旁组织也能靶向零星存在的肿瘤细胞核，正常组织内无法进入细胞核，在间质内分散分布，说明gqds的肿瘤细胞核靶向效果灵敏。验证了gqds也可以作为探针应用于早期肝癌检测，高效识别癌旁组织及正常组织界面。具体结果参见图3，4。

参考文献：

[1]李银鹏，朱惠明，吴本华.c57bl/6j小鼠原位肝癌模型的建立及高频超声对原位癌的监测[j].胃肠病学和肝病学杂志,2010,19(2):145-147.