鼻咽癌的生物标志物组合、检测试剂盒及应用的制作方法

本发明属于肿瘤生物
技术领域：
，涉及用于鼻咽癌的生物标志物、检测试剂盒及应用。
背景技术：
：鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，npc)是一种发生于鼻咽粘膜，具有较高恶性程度和极强转移能力的恶性肿瘤。鼻咽癌是多基因遗传性疾病，其发病与遗传因素(遗传易感性)、eb病毒感染、环境因素、饮食习惯等多种因素有关，早期诊断、早期治疗是挽救患者生命和提高生活质量的最有效手段。遗憾的是，鼻咽癌起病隐匿，具有强烈的转移倾向。据统计，约75％的患者在就诊时就已到达晚期，发生局部淋巴结和/或远处转移，治疗后复发或转移则预后极差，成为鼻咽癌治疗失败的主要原因。因此，筛查鼻咽癌的肿瘤标记物，争取早期发现、选择最佳治疗方案、预测预后、监测复发或转移对鼻咽癌诊疗具有重要的临床意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供鼻咽癌的生物标志物组合、检测试剂盒及应用。本发明所采取的技术方案是：特异性识别细胞因子sell，ccl24，mmp3，msp-alpha，hcc-4中至少一种的试剂在制备鼻咽癌辅助诊断试剂盒中的应用。能对细胞因子sell，ccl24，mmp3，msp-alpha、hcc-4中至少一种进行定量的试剂在制备鼻咽癌辅助诊断试剂盒中的应用。特异性识别细胞因子timp-2，igf-i，il-8，sell，ccl24，mmp3，msp-alpha和hcc-4的试剂在制备鼻咽癌辅助诊断试剂盒中的应用。能对细胞因子timp-2，igf-i，il-8，sell，ccl24，mmp3，msp-alpha和hcc-4进行定量的试剂在制备鼻咽癌辅助诊断试剂盒中的应用。一种鼻咽癌的辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有特异性识别细胞因子sell，ccl24，mmp3，msp-alpha，hcc-4中至少一种的试剂。一种鼻咽癌的辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有能对细胞因子sell，ccl24，mmp3，msp-alpha、hcc-4中至少一种进行定量的试剂。一种鼻咽癌的辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有特异性识别细胞因子timp-2，igf-i，il-8，sell，ccl24，mmp3，msp-alpha和hcc-4的试剂。一种鼻咽癌的辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有能对细胞因子timp-2，igf-i，il-8，sell，ccl24，mmp3，msp-alpha和hcc-4进行定量的试剂。进一步的，上述试剂盒的检测原理为elisa原理。本发明的有益效果是：本发明发现血清标志物细胞因子timp-2，igf-i，il-8，sell，ccl24，mmp3，msp-alpha和hcc-4和鼻咽癌密切相关，可用于临床诊断及预防检测，具有很好的实际应用价值。且直接针对血清中的标志物进行检查，使得操作方便、快速，适于推广应用。附图说明图1为细胞因子芯片检测后的荧光扫描检测图；图2为蛋白芯片数据的箱线图；箱线图中的横线是整个组的数据的中位数。图3为差异表达细胞因子的非层次聚类分析图；绿色平均值代表低丰度蛋白，黑色代表中位数水平，红色代表高丰度蛋白。图4为elisa法检测细胞因子的表达量。具体实施方式在本发明中，提供了一种测量针对一组特异性肿瘤生物标志物以对癌症进行筛查检测和定量方法。与正常人比较，鼻咽癌患者血清中可能含存在一些具有表达差异的细胞因子。对该组独特的蛋白(生物标志物)的评价将对常规诊断方法进行补充并有利于癌症的早期诊断。本发明收集12例，没有接受过化疗和放疗的，经过免疫组化和病理诊断确诊为鼻咽癌患者的血液样本，同时收集12例健康人的血液样本作为对照。通过使用基于蛋白芯片的方法，在本发明中从患者的血清中鉴定了一组鼻咽癌癌生物标志物，相对于正常对照样本，包括timp-2,sell,ccl24,mmp3,igf-i和il-8在鼻咽癌患者血清中上调，而msp-alpha和hcc-4下调。用elisa方法验证了此组鼻咽癌生物标志物的特异性和准确性，并一起用于筛查鼻咽癌。测试后的数据用spss统计软件进行分析，组间差异用student’sttest来分析，p<0.05被认为是有统计学意义。下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。实施例11)样本准备从南方医科大学附属佛山第一人民医院病理系收集12例，没有接受过化疗和放疗的，经过免疫组化和病理诊断确诊为鼻咽癌患者的血液样本，同时收集12例健康人的血液样本作为对照，样品信息见表要。将血液样本离心取上层血清。表1临床样本信息患者数量12人年龄(mean±sd),岁49.4±8.9性别男性＝50％，女性＝50％疾病分期ii＝75％,iii＝25％治疗否健康对照数量12人年龄(mean±sd),岁44.1±5.1性别男性＝50％,女性＝50％p-value(年龄,患者vs健康对照)0.0852)芯片筛选血清标志物实验方法：本实施例采用raybio公司人细胞因子芯片humancytokineantibodyarray(raybiohumancytokineantibodyarraygseries2000,catno:aah-cyt-g2000,raybiotechco,norcrossga,usa)检测血清中174种细胞因子。将上步收集的血清稀释二倍之后，加入细胞因子芯片中孵育二个小时。洗涤之后,加入biotin偶联的抗体复合物室温孵育2小时。洗涤之后,加入cy3-conjugatedstreptavidin到蛋白芯片上孵育2小时。最后,用genepix4000b扫描仪(axoninstruments,genepixversion5.0)扫描芯片，信号用genepix4000b软件获取，然后用raybiotech公司分析工具分析(raybiotechanalysistool，excel特定软件)。实验结果：1)芯片扫描对上述24份血清样本(12健康者，12例鼻咽癌患者)进行芯片扫描，扫描结果如图1所示，蛋白丰度与荧光强度成正比，芯片中每个样品重复检测2次。从荧光图片上可以看到方框内的荧光信号在对照组(control)和鼻咽癌患者组(npc)中存在明显的荧光差异，提示说明这些细胞因子在鼻咽癌患者体内的表达量可能存在显著的差异，其中，timp-2、sell、ccl24、mmp3、igf-i和il-8在鼻咽癌患者血清中上调，而msp-alpha和hcc-4下调。进一步对相应的荧光信号进行定量，定量结果如表2所示，表2为12例健康者的血清中8种细胞因子在芯片上的荧光信号值，为12例鼻咽癌患者的血清中8种细胞因子在芯片上的荧光信号值。3)芯片扫描数据分析及标志物的确定1.芯片扫描数据的t-test分析利用芯片分析软件中的t-test方法对上述芯片荧光值进行分析，其中有8种细胞因子的荧光信号强度(代表细胞因子含量)在正常人群和鼻咽癌患者中存在显著性差异(p<0.05)，具体分析结果如表2。分析结果显示有5种细胞因子鼻咽癌患者的血清中上调表达，有3种细胞因子下调表达。表2蛋白芯片数据分析结果(鼻咽癌患者vs健康对照)2.箱线图分析对上述蛋白芯片的统计数据进行t检验分析之后，二组之间部分有显著性差异(p<0.05)的血清标志物用箱线图(boxplot)表述；箱线图中的横线是整个组的数据的中位数。箱线图如图2所示。采用spss统计软件进行分析，统计方法均数间比较采用t检验，组间差异用student’sttest来分析，p<0.05被认为是有统计学意义和p<0.01(差异非常显著)定为有统计学意义。从表2和图2的分析中可以看出，分析肿瘤患者血清和正常人血清中174个因子的表达水平，结果显示包括timp2,sell,ccl24,mmp3,igf-i和il-8在鼻咽癌患者血清中上调，而msp-alpha和hcc-4下调。3.非层次聚类分析用cluster3.0software软件采用非层次聚类分析(unsupervised-hierarchicalclusteranalysis)分析具有显著表达差异的8个血清标志物(timp-2、sell、ccl24、mmp3、igf-i、il-8、msp-alpha和hcc-4)，分析结果如图3所示，从中可以看出这8个血清标志物完全能够将npc组和对照组显著区分开。说明利用上述8种细胞因子作为诊断鼻咽癌的指标，效果良好。用cluster3.0software软件采用非层次聚类分析(unsupervised-hierarchicalclusteranalysis)分析8个差异显著的血清标志物，结果显示npc组和对照组能显著区分.(3)elisa验证血清标志物收集另外20例正常样本和20例鼻咽癌患者(npc)血清样本，用购买的商品化的试剂盒(raybiotech,norcrossga,usa)，根据厂家使用说明操作，进一步检测上述存在表达差异的细胞因子，其中包括timp-2,sell,ccl24,mmp3,igf-i,il-8,msp-alpha和hcc-4。将稀释后血清样本分别加入相应的elisa板中，室温孵育2.5小时。洗涤elisa板子三次之后，加入生物素偶联的抗体(biotin-conjugatedantibody)孵育2小时。洗涤elisa板子三次之后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(hrp-conjugatedstreptavidin)孵育30分钟，洗涤三次之后加入tmb底物显色。最后，加入硫酸(sulfuricacid)中止反应，用酶标仪microplatereader(biorek,usa,elx800nb)分析光密度。采用spss统计软件进行分析，统计方法均数间比较采用t检验,组间差异用student’sttest来分析，p<0.05被认为是有统计学意义和p<0.01(差异非常显著)定为有统计学意义。分析鼻咽癌患者血清和正常人血清中174个细胞因子的表达水平。检测结果如图4所示，从中可以看出，timp-2、sell、ccl24、mmp3、igf-i和il-8在鼻咽癌患者血清中上调，而msp-alpha和hcc-4下调，与细胞因子芯片检测结果一用t检验分析验证后的elisa数据，elisa结果和蛋白芯片结果一致。npc组和对照组(p<0.05，mann-whitneyutestanalysis)。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12