丝胶蛋白神经导管及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种丝胶蛋白神经导管及其制备方法与应用，属于医学生物材料领 域。
【背景技术】
[0002] 外周神经损伤是较为常见的疾病，通常由交通事故、自然灾害、战争等导致的创伤 以及肿瘤切除、先天畸形等原因造成，约有2. 8%的创伤病可导致外周神经损伤，造成神经 断裂。外周神经损伤通常导致病人的感觉和运动功能障碍，致残率高，严重影响病人的生活 质量，给家庭、社会带来巨大的经济负担。
[0003] 外周神经损伤治疗原则是尽可能早地恢复神经的连续性，目前的治疗方法主要有 自体神经移植、异体神经移植、断端无张力直接缝合和组织工程方法。其中，自体神经移植 修复效果较好，但有以下弊端：I )截取供体神经既带来副损伤，又会导致供体神经支配的 区域感觉缺失；II )供体限制取材的长度；III)在截取供体神经的位置还可能因此形成神 经瘤而需要再次手术。异体神经移植存在免疫排斥反应等问题。而断端无张力直接缝合 的治疗方法通常会导致神经瘤或瘢痕组织的形成从而阻碍神经的修复，并且仅局限于〈5_ 的短距离外周神经损伤。
[0004] 相比之下，运用组织工程方法修复外周神经损伤是较理想的治疗方法，也是目前 外周神经损伤与再生的研究重点。组织工程方法主要是利用神经导管连结损伤神经的两个 断端，并促使神经细胞在神经导管上粘附、增殖、迀移和定向排列，从而诱导神经再生，达到 恢复神经连续性的目的。
[0005] 制备神经导管的材料可使用如聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA)、聚L-乳酸 (PLLA)、聚苯醚（PPE)、聚乙交己内酯（PGCL)和聚甲基丙烯酸羟乙酯-甲基丙烯酸甲酯 (PHEMA-MMA)等人工合成材料。然而，采用人工合成材料制备神经导管的工艺比较复杂，产 品价格昂贵，且部分材料降解产物对人体具有毒副作用（如PLGA等降解产物为酸性）。
[0006] 或者，也可以采用如海藻酸盐、壳聚糖、胶原和丝素等等的天然材料制备神经导 管，其具有良好的生物相容性，对人体无毒副作用。但这类材料性能不稳定，因宿主酶环境 的变化而不易其调节降解性能，且其机械加工性能较差，难以实现规模化生产；此外，上述 天然材料制作的神经导管对于短距离的神经损伤（利用大鼠作为动物模型，1〇_及以下的 神经损伤）具有较好的恢复效果，而对于长距离神经损伤（利用大鼠作为动物模型，超过 15mm的神经损伤）在结构和功能方面的恢复均不够理想，难以达到与自体神经移植相当的 水平。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种丝胶蛋白神经导管，具有良好生物活性和生物相容性，能促进神 经细胞粘附、增殖、迀移和定向排列，可以在体内自然降解并促进长距离损伤的外周神经再 生，同时所述丝胶蛋白神经导管具有优良的物理机械性能。
[0008] 本发明还提供一种上述丝胶蛋白神经导管的制备方法，工艺简单，成本低廉，同时 有利于产品的质量控制以及大规模生产。
[0009] 本发明还提供了上述丝胶蛋白神经导管在制备神经移植物中的应用。
[0010] 本发明首先提供一种丝胶蛋白神经导管，其成分为丝胶蛋白。丝胶蛋白是包裹在 丝素纤维表层的一种天然大分子蛋白，具有良好的生物相容性和生物降解性，可在修复完 成后完全降解，且降解产物为氨基酸（主要为丝氨酸、天冬氨酸和甘氨酸），降解产物不仅 对机体无毒，能被机体代谢，且具有神经营养作用。本发明人研究发现丝胶蛋白具有支持神 经细胞的黏附、增殖、迀移与生长等特性，是用于神经修复的理想生物材料。
[0011] 进一步地，本发明提供的丝胶蛋白神经导管是采用丝素缺失型突变品种家蚕的蚕 茧作为原料提取丝胶蛋白，并经共价交联剂交联成型后获得的。其中，家蚕丝素缺失型突变 品种蚕茧可以购自中国农业科学院蚕业研究所，该类品种资源保存于中国农业科学院蚕业 研究所国家蚕资源保存中心。
[0012] 由于丝胶蛋白优异的生物相容性和生物活性，该丝胶蛋白神经导管尤其可应用于 长距离外周神经损伤的修复与再生。例如该丝胶蛋白神经导管的尺寸可为：内径1~3mm， 管壁厚0. 5~1mm，长度15~30mm。
[0013] 本发明还提供了一种上述丝胶蛋白神经导管的制备方法，包括以下步骤：
[0014] 采用丝素缺失型突变品种家蚕的蚕茧作为原料，将其粉碎并经紫外线或乙醇灭 菌，然后使用LiBr或LiCl水溶液进行丝胶蛋白的提取，将提取物制成浓度为0. 5~20wt % 的丝胶蛋白水溶液；
[0015] 在所述丝胶蛋白水溶液中加入共价交联剂，混匀后注入模具中成型，得到丝胶蛋 白神经导管半成品，所述共价交联剂的使用量为每1毫升丝胶蛋白水溶液加入2~500 μ L 浓度为〇. 1~50wt %的共价交联剂；
[0016] 将所述丝胶蛋白神经导管半成品冷冻干燥，得到所述丝胶蛋白神经导管。
[0017] 其中，粉碎为可以采用剪刀将蚕茧剪碎或其他能使其破碎的方法。灭菌方法可 采用紫外照射法，把蚕茧粉碎成1mm2左右，用紫外线分别照射正反面至少5min ;或者采用 乙醇浸泡法，将蚕茧粉碎成1mm2左右，用70%~80%体积浓度的乙醇至少浸泡5min，在 3500r/min条件下离心5分钟，去掉乙醇；还可以将上述紫外照射法和乙醇浸泡法联合应 用，先用紫外线照射正反面，再用乙醇浸泡，然后离心去掉乙醇。上述三种方法均可达到满 意的灭菌效果。
[0018] 进一步地，制取所述丝胶蛋白水溶液的方法包括：
[0019] 1)采用丝素缺失型突变品种家蚕的蚕茧作为原料，将其粉碎并灭菌，在25~ 50°C，采用浓度为6~8mol/L的LiBr或LiCl水溶液，在25~50°C进行提取处理5~24 小时，每克蚕茧碎片采用20~100mL 6~8mol/L的LiBr或LiCl水溶液进行提取；
[0020] 2)将步骤1)得到的提取物离心，去除不溶性物质，得到澄清溶液；
[0021] 3)向步骤2)得到的澄清溶液中加入0· 5-3mol/L、pH 8. 0~11. 0的Tris-HCl缓 冲液，并在超纯水中进行透析；
[0022] 4)将步骤3)得到的透析液离心去除沉淀，浓缩得到浓度为0.5~20wt%的丝 胶蛋白水溶液。在本发明的一个实施例中，可使所述丝胶蛋白水溶液的浓度为1. 5~ 15. Owt%，以取得更好的交联效果
[0023] 上述丝胶蛋白水溶液的制备过程在无菌环境中操作，所用原料和设备均经灭菌处 理，例如，所用的超纯水、透析袋用前均采用高压灭菌，所用的LiBr水溶液、三羟甲基氨基 甲烷盐酸盐（Tris-HCl)、交联剂均经过0. 22um滤器过滤除菌，乙醇为经过亲水性0. 22um滤 器过滤后，用灭菌的超纯水配置而成。
[0024] 上述共价交联剂可选择戊二醛、丙二醛和京尼平等中的一种或多种。例如，本发明 的一个实施例中可使用浓度为〇. 1~25wt%的京尼平。
[0025] 进一步地，在所述丝胶蛋白水溶液中加入所述共价交联剂，混匀后注入模具，在 4~45°C下维持至少5秒使之成型，得到丝胶蛋白神经导管半成品。在一个【具体实施方式】 中，可将其置于室温下5~15秒成型。在此过程中，丝胶蛋白在交联剂的作用下发生交联 反应，得到丝胶蛋白神经导管半成品。
[0026] 为了利于增加神经导管的孔隙度，可将丝胶蛋白神经导管半成品冷冻干燥之前， 在零度以下冷冻成型，例如，置于_2〇°C至_190°C下（一般可以置于液氮中）冷冻至少4小 时，可更有利于负载生长因子和药物等。
[0027] 上述丝胶蛋白神经导管（尺寸可