胞(沉淀)，种子细胞进行GFP转染，将GFP基因转入种子细胞并使其表达，然后在转染有GFP基因的种子细胞中加入诱导分化培养基吹打混匀，将该含有种子细胞的诱导分化培养基分别移入预先底层铺有PLGA膜片并用基质胶Matrigel包被的96孔板中(种植密度:I X 15个/cm2)，摇动孔板使细胞均匀，37°C、5%C02饱和湿度下进行培养；所述的诱导分化培养基为:每ml含有bFGF 1ng,BDNF 20ng、CNTF20ng、N2 supplement lng、非必须氨基酉爱(essential media-non essential amino acids他八六8)1即、肝素248，余量为0腿1/^12培养基，所述的0腿1/^12培养基是由0腿1培养基和F12培养基按照体积比I: I混合而成。其配制方法为:将DMEM培养基和F12培养基按照体积比I: I混合形成DMEM/F12培养基，然后按照上述成份的含量，在DMEM/F12培养基中添加bFGF、BDNF、CNTF、N2 supp I ement、非必须氨基酸和肝素，混合均匀而得诱导分化培养基。
[0020]2、细胞贴膜培养至14天，吸除培养孔培养基，I X PBS洗2遍，加入质量分数4%PFA(多聚甲醛)室温固定5min后，弃固定液，I XPBS洗3遍，每遍5min，加入PB液(0.2%Triton100+10%驴血清)，室温下打孔及封闭，15-20min;
[0021]3、孵育一抗(冰上操作):弃0.5%Triton+驴血清，用ADS液(0.04%Triton χ-100with 2%donkey serum)稀释一抗ant1-Navl.1 (比例1: 200) ； 37°C过夜后，弃一抗，用I XPBS洗3遍，每遍5min ；
[0022]4、孵育二抗(避光操作):ADS液稀释(比例1:500)二抗(LifeTech ALEXA FLUOR555 DONKEY A31572)室温下孵育lh。弃二抗，用I XPBS洗3遍，每遍5min;
[0023]5、DAPI染核 5min,每个样品 200yl，lXPBS洗I 遍；
[0024]6、将膜片一干净载玻片，滴一滴抗荧光猝灭剂，将盖玻片盖在猝灭剂上。
[0025]7、活细胞显微镜下观察细胞钠离子通道染色。
[0026]如附图1和2所示，蓝色荧光显示细胞核，绿色荧光显示细胞整体，两者同一视野下图像吻合，共同在膜片上标识出了细胞的位置；附图3中，膜片上有细胞存在的位置显示较强红色荧光，红色荧光与背景分界清楚，从附图4合成图像中可以看到，同一视野下红色荧光部分与细胞核及细胞的部分完全吻合，从荧光强度及位置表明，膜片上神经样细胞表达钠离子通道蛋白。
[0027]钠离子通道是由细胞膜上的特殊蛋白质形成的可以让钠离子通过细胞膜的通道。钠离子通道根据启动方式可分为电压门控型通道及配体门控型通道，其中电压门控型钠离子通道与细胞膜动作电位关系密切。细胞电活动是生命现象的基本特征之一，而离子通道是其结构和功能的基础。因此，研究PLGA膜片上钠离子通道表达及细胞膜动作电位情况具有重要意义。本发明用电压门控钠离子通道蛋白特异抗体对PLGA上膜片神经样细胞的钠离子通道蛋白进行检测，结果显示神经样细胞上有钠离子通道蛋白表达，为后续研究细胞膜上动作电位功能提供了结构基础。
【主权项】
1.一种基于组织支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞，以该单细胞作为种子细胞经诱导分化培养基重悬后接入包被基质胶Matrigel的聚乳酸-羟基乙酸聚合物支架上，于诱导分化培养基中进行培养，所述的诱导分化培养基为含有神经营养因子和维持浓度的视网膜分化营养液组成的培养基;对培养到一定时期的聚乳酸-羟基乙酸聚合物支架上的神经样细胞进行钠离子通道检测，检测其神经基础功能。2.根据权利要求1所述的基于组织支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道检测方法，其特征在于，所述的诱导分化培养基为:每ml含有bFGF 1ng,BDNF 20ng、CNTF 20ng、N2 supplement lng、非必须氨基酸lng、肝素2yg，余量为DMEM/F12培养基，所述的DMEM/F12培养基是由DMEM培养基和F12培养基按照体积比1:1混合而成。3.根据权利要求1所述的基于组织支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道检测方法，其特征在于，所述的培养是在37°C、5 % C02，饱和湿度下进行培养。4.根据权利要求1所述的基于组织支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道检测方法，其特征在于，所述的将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞是将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层放入D-Hanks液中，分离组织，离弃视网膜组织中色素沉着部分，保留金黄色的组织部分的神经纤维层，将分离的神经纤维层组织用PBS冲洗，吸除PBS后用accutase细胞消化液消化细胞团成单细胞后加入诱导分化培养基终止消化，混悬液离心去上清后，得到种子细胞。5.根据权利要求1所述的基于组织支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道检测方法，其特征在于，所述的钠离子通道检测是将培养到一定时期的聚乳酸-羟基乙酸聚合物支架上的神经样细胞，吸除其培养基，用PBS洗涤后，用固定液固定，再弃固定液，用PBS洗涤，然后加入PB液，打孔封闭，孵育一抗、二抗、然后DAPI染核，置于载玻片上，加入抗荧光猝灭剂，将盖玻片盖在猝灭剂上，活细胞显微镜下观察细胞钠离子通道染色。
【专利摘要】本发明公开了一种基于组织支架的三维视杯来源神经样细胞的钠离子通道检测方法。它是将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞，以该单细胞作为种子细胞经诱导分化培养基重悬后接入包被基质胶Matrigel的聚乳酸-羟基乙酸聚合物支架上，于诱导分化培养基中进行培养，所述的诱导分化培养基为含有神经营养因子和维持浓度的视网膜分化营养液组成的培养基；对培养到一定时期的聚乳酸-羟基乙酸聚合物支架上的神经样细胞进行钠离子通道检测，检测其神经基础功能。选择对PLGA膜片上培养的神经细胞进行钠离子通道免疫荧光染色，更加真实的反映组织膜片上细胞的状态，为进一步对膜片上细胞进行膜片钳检测功能电位提供依据及基础。
【IPC分类】G01N33/68
【公开号】CN105445476
【申请号】CN201510952749
【发明人】葛坚, 顾怀宇, 钟秀风, 李康寯, 杨斯婧
【申请人】中山大学中山眼科中心
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月17日