拉霉 素的DMSO溶液(被检物质3)。
[0176] (2-1)含被检物质的培养基的制备
[0177]将各被检物质在稀释调整前利用旋涡混合器进行了 15秒钟以上搅拌。作为金黄色 葡萄球菌亚种.球菌(Staphylococcus aureus subsp. aureus))接种用培养基，利用水解酪 蛋白（Mueller HintonHI肉汤培养基将含克拉霉素的样品（被检物质1~3)稀释为250yg/ mL之后，进行2倍系列稀释，制备了所含的最终药剂浓度为0.012~25yg/mL的培养基。另外， 作为绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)接种用培养基，利用水解酪蛋白II肉汤培养基将 含克拉霉素的样品（被检物质1~3)稀释为lOOOyg/mL之后，进行2倍系列稀释，制备了所含 的最终药剂浓度为0.049~100yg/mL的培养基。
[0178]制作的各含有被检物质的培养基按照每1孔0.1 ±0.02mL分注于U字型微孔板。作 为对照，将不含药剂的培养基分别分注于2孔。
[0179] (2-2)接种菌液的制备
[0180]利用水解酪蛋白II琼脂培养基对金黄色葡萄球菌亚种.球菌（Staphylococcus aureus subsp. aureus)或绿胺杆菌（Pseudomonas aeruginosa)进行培养过夜。使琼脂平 板上的新鲜培养菌在灭菌生理盐水中以相当于〇.5McFarand(约10 8CFU/mL)悬浮，并利用灭 菌生理盐水将其进一步稀释至10倍(约107CFU/mL)，制备了接种菌液。
[0181] (2-3)接种菌液的接种及培养
[0182] 在分注有含被检物质的培养基及不含被检物质的培养基的各孔中接种上述(2-2) 中制备的金黄色葡萄球菌亚种·球菌(Staphylococcus aureus subsp .aureus))或绿脓杆 菌(Pseudomonas aeruginosa)的接种菌液0 · 005mL(最终接种菌量：约IO4CFU/孔）。将在不 含被检物质的培养基孔中未接种菌液的情况作为阴性对照。接种后，于35±1°C进行了 18~ 24小时培养。
[0183] (2-4)判定
[0184] 对用于对照的不含被检物质的培养基孔中的发育进行确认之后，以肉眼未确认到 菌的发育的孔中的最小药剂浓度作为最小抑菌浓度(MIC)。具体而言，在肉眼可观察到混浊 或直径Imm以上的沉淀的情况下、以及虽然沉淀物的直径在Imm以下但可观察到2个以上沉 淀块的情况下，判定为发育阳性( + )，在肉眼未确认到混浊或沉淀的情况下、以及虽然发生 沉淀但直径为1mm以下且为1个的情况下，判定为发育抑制(_)。
[0185] (3)结果
[0186] 结果如表4所示。由该结果表明，经过了纳米化的克拉霉素与未粉碎及溶解的克拉 霉素保持了同等的抗菌活性。
[0187] [表 4]
[0190](实验例7)眼刺激性试验
[0191 ] (1)纳米化克拉霉素悬浮剂的制作
[0192] (1-1)克拉霉素的粉碎
[0193] 在IL TRIMIX(井上制作所制）中进料平均粒径10,370nm的克拉霉素（熔点：217_ 220°C;Assia Chemical Industries Ltd. )30.1g、甘露糖醇(和光纯药社制)90.1g、聚乙稀 吡咯烷酮K25(和光纯药工业公司制）8.9g、及氢化大豆卵磷脂PH0SPH0LIP0N 90H (H.Holstein公司制）12.0g，混合至均一之后，注入甘油21.5g，使内容物保持为生面团状， 于5°C进行了 5小时粉碎。所得混炼面团的回收量为136.6g(回收率84%)。
[0194] (1-2)纳米化克拉霉素的粒度分布测定
[0195] 向所得混炼面团IOOmg中加入0· l%HC0_60(Nihon Surfactant kogyo公司制）3g， 使用浴槽型超声波分散机(型号:VS-100III、AS〇ne公司制)进行了数分钟分散处理。利用粒 度分布测定装置(装置名：DeLsaNano、Beckman Cou I ter公司制）对克拉霉素的粒度分布进 行测定的结果，平均粒径(Dv)为159.7nm。
[0196] (1-3)纳米化克拉霉素悬浮剂(克拉霉素浓度0.3 % )的制作
[0197] 在50mL的玻璃样品瓶中量取TRIMIX粉碎后的克拉霉素混炼物(混炼面团）1.25g， 并向其中加入l%HC0-60(Nihon Surfactant kogyo公司制）水溶液10g，使用浴槽型超声波 分散机（型号:VS-100III、AS〇n e公司制）进行了 1~2分钟分散处理。进一步，利用探针式超 声波分散机(型号：S-4000、MIS0NIX公司制)进行了 1分钟分散处理。然后，依次添加1%HC0-60水溶液10g、I%HPMC(60SH-50)水溶液17.5g、IM Tris缓冲液7.5g、0.1 %苯扎氯铵水溶液 〇. 75g，进一步添加纯化水并使整体量达到75g。最后，利用磁力搅拌器进行30分钟搅拌，得 到了纳米化克拉霉素悬浮剂(克拉霉素浓度0.3 %)。
[0198] (1-4)纳米化克拉霉素悬浮剂(克拉霉素浓度1.0% )的制作
[0199] 在烧杯中量取TR頂IX粉碎后的克拉霉素混炼物(混炼面团）4.05g，并向其中加入 I %HC0-60(Nihon Surfactant kogyo公司制）水溶液33.5g，使用浴槽型超声波分散机（型 号:VS-100III、AS〇n e公司制)进行了 1~2分钟分散处理。进一步，利用探针式超声波分散机 (型号：S-4000、MIS0NIX公司制）进行了 1分钟分散处理。然后，依次添加1%HPMC(60SH_50) 水溶液17.5g、IM Tris缓冲液7.5g、0.1 %苯扎氯铵水溶液0.75g，进一步添加纯化水并使整 体量达到75g。最后，利用磁力搅拌器进行30分钟搅拌，得到了纳米化克拉霉素悬浮剂(克拉 霉素浓度1.0%)。
[0200] (1 -5)克拉霉素原粉悬浮剂(克拉霉素浓度1.0 %)的制作
[0201] 在烧杯中量取克拉霉素0.75g，并向其中加入l%HC0-60(Nihon Surfactant kogyo公司制）水溶液33.5g，使用浴槽型超声波分散机(型号:VS-100III、Asone公司制）进 行了 1~2分钟分散处理。进一步，利用探针式超声波分散机(型号:S-4000、MIS0NIX公司制） 进行了 1分钟分散处理。然后，依次添加1 %HPMC(60SH-50)水溶液17.5g、IM Tr is缓冲液 7.5g、0.1 %苯扎氯铵水溶液0.75g，进一步添加纯化水并使整体量达到75g。最后，利用磁力 搅拌器进行30分钟搅拌，得到了克拉霉素原粉悬浮剂(克拉霉素浓度1.0%)。
[0202] (2)评价试验
[0203] (2-1)对兔眼按照每次间隔30分~数小时、每天1次~20次的方式分别滴加(a)生 理盐水、上述（1)中制作的（b)纳米化克拉霉素悬浮剂(克拉霉素浓度0.3 % )、（ C)纳米化克 拉霉素悬浮剂(克拉霉素浓度1.0% )、（d)克拉霉素原粉悬浮剂（克拉霉素浓度1.0% )、或 (eMzasite(注册商标）（阳性对照）（阿奇霉素浓度0.3%)之后，滴加荧光素，观察角膜染色 斑，由此对眼刺激性进行评价。
[0204] (2-2)对兔的单眼分别滴加50yL的上述（1)中制作的（b)纳米化克拉霉素悬浮剂 (克拉霉素浓度0.3% )、（c)纳米化克拉霉素悬浮剂(克拉霉素浓度1.0% )，经过6小时对眼 刺激性进行了目测评价。其结果，（b)及(c)的两纳米化克拉霉素悬浮剂的情况下均未观察 到眨眼次数的增加、眼的充血及分泌物，未确认到眼刺激性。
[0205] (2-3)按照每次间隔30分~数小时、每天1次~20次的方式对兔的单眼滴加作为对 象的生理盐水、对另一眼滴加上述制剂(b)~(e)，并对眨眼次数和眼刺激性进行评价。关于 眼刺激性的评价，在给药前、最终给药后1、3、5、24小时针对两眼的角膜、虹膜及结膜进行观 察，并按照Dra i z e的评价基准进行评分，从而进行了判定。
[0206] 可以认为，与作为阳性对照的Azasite的眼刺激性相比，纳米化克拉霉素悬浮剂的 眼刺激性为同等或更低。
[0207] (实施例8)使用感染性模型动物的药效试验
[0208] (1)使白色兔的角膜受伤之后，向其眼睛滴加绿脓杆菌，由此制作了角膜感染症模 型。自菌接种数小时后起，以每天1次~10次的方式对兔的单眼滴加生理盐水、对另一眼滴 加实施例7中制备的制剂(b)~(e)，滴加3天~5天，自菌接种数小时后起，每隔24小时对外 眼部感染症状进行观察，并持续进行4~8天的观察。外眼部感染症状按照秦野等/中村等的 评价基准或Dra i z e的评价基准进行评分，从而进行了判定。
[0209] (2)通过在白色兔的结膜囊内接种绿脓杆菌，制作了角膜感染症模型。在确认到角 膜炎发病(菌接种5~10小时）之后，以每天1次~10次的方式对兔的单眼滴加生理盐水、对 另一眼滴加实施例7中制备的制剂(b)~(e)，滴加3天~5天，自菌接种数小时后起，每隔24 小时对外眼部感染症状进行观察，并持续进行4~8天的观察。外眼部感染症状按照秦野等/ 中村等的评价基准或Dra i z e的评价基准进行评分，从而进行了判定。
[0210] ⑶使白色兔的角膜受伤之后，向其眼睛滴加金黄色葡萄球菌，由此制作了角膜感 染症模型。自菌接种数小时后起，以每天1次~10次的方式对兔的单眼滴加生理盐水、对另 一眼滴加实施例7中制备的制剂(b)~（e)，滴加3天~5天，自菌接种数小时后起，每隔24小 时对外眼部感染症状进行观察，并持续进行4~8天的观察。外眼部感染症状按照秦野等/中 村等的评价基准或Dra i z e的评价基准进行评分，从而进行了判定。
[0211] (4)通过向白色兔的角膜基质内注入金黄色葡萄球菌，制作了角膜感染症模型。自 菌接种数小时后起，以每天1次~10次的方式对兔的单眼滴加生理盐水、对另一眼滴加实施 例7中制备的制剂(b)~（e)，滴加3天~5天，自菌接种数小时后起，每隔24小时对外眼部感 染症状进行观察，并持续进行4~8天的观察。外眼部感染症状按照秦野等/中村等的评价基 准或Dra i z e的评价基准进行评分，从而进行了判定。
[0212] 可以认为，与作为阳性对照的Azasite相比，纳米化克拉霉素悬浮剂的基于目测的 眼刺激性（角膜混浊、眼睑结膜充血、眼睑结膜浮肿、眼球结膜充血)为同等或更低。另外可 以认为，与作为阳性对照的Azasite相比，纳米化克拉霉素悬浮剂的抗菌/抗炎症效果为同 等或其以上。
[0213](实施例9)使用了炎症性模型动物的药效试验
[0214] (1)通过对大鼠的上眼睑结膜注射2%花生四烯酸而制作了急性结膜浮肿(结膜炎 模型）。在注射花生四烯酸之前，每隔15分钟~30分钟向大鼠的眼睛滴加实施例7中制备的 制剂(a)~（e)，滴加1次~数次，在注射花生四烯酸3小时~6小时后屠杀大鼠，沿着眼睑缘 将浮肿部位切下，测定其重量。计算制剂滴眼群相对于生理盐水滴眼群的浮肿重量减少比 例，从而评价了对结膜浮肿的抑制效果。
[0215] (2)通过对大鼠的上眼睑结膜注射1%角叉菜胶而制作了急性结膜浮肿(结膜炎模 型）。在注射角叉菜胶之前，每隔15分钟~30分钟向大鼠的眼睛滴加实施例7中制备的制剂 (a)~(e)，滴加1次~4次，在注射角叉菜胶3小时~6小时后屠杀大鼠，沿着眼睑缘将浮肿部 位切下，测定其重量。计算制剂滴眼群相对于生理盐水滴眼群的浮肿重量减少比例，从而评 价了对结膜浮肿的抑制效果。
[0216] (3)通过对大鼠的上眼睑结膜注射1%角叉菜胶而制作了急性结膜浮肿(结膜炎模 型）。另外，在刚刚注射角叉菜胶之后自尾静脉进行1%伊凡氏蓝的给药。在注射角叉菜胶之 前，每隔15分钟~30分钟向大鼠的单眼(右眼)滴加实施例7中制备的制剂(b)~(e)、向另一 目艮（左眼)滴加生理盐水，滴加1次~4次，在注射角叉菜胶3小时~6小时后屠杀大鼠，并摘除 眼睑皮肤。将该眼睑皮肤加入Falcon管中，加入甲酰胺并在冰箱内浸渍过夜，使用分光光度 计，由620nm的吸光度求出了离心分离后的上清中所含的伊凡氏蓝的色素量。以如下所示的 色素漏出量的抑制率评价了对结膜浮肿的抑制效果。
[0217] 抑制率（％) = {(左眼的色素漏出量-右眼的色素漏出量)/左眼的色素漏出量} X 100
[0218] (4)通过对大鼠的上眼睑结膜注射1%福尔马林而制作了急性结膜浮肿(结膜炎模 型）。在注射福尔马林之前，每隔15分钟~30分钟向大鼠的眼睛滴加实施例7中制备的制剂 (a)~(e)，滴加1次~4次，在注射福尔马林3小时~6小时后屠杀大鼠，沿着眼睑缘将浮肿部 位切下，测定其重量。计算制剂滴眼群相对于生理盐水滴眼群的浮肿重量减少比例，从而评 价了对结膜浮肿的抑制效果。
[0219] (5)通过对大鼠的上眼睑结膜注射10%高岭土而制作了急性结膜浮肿(结膜炎模 型）。在注射高岭土之前，每隔15分钟~30分钟向大鼠的眼睛滴加实施例7中制备的制剂(a) ~(e)，滴加1次~4次，在注射高岭土3小时~6小时后屠杀大鼠，沿着眼睑缘将浮肿部位切 下，测定其重量。计算制剂滴眼群相对于生理盐水滴眼群的浮肿重量减少比例，从而评价了 对结膜浮肿的抑制效果。
[0220] (6)通过向大鼠的结膜囊内滴加10%巴豆油而制作了急性结膜浮肿（结膜炎模 型）。在滴加巴豆油之前，每隔30分钟~50分钟向大鼠的眼睛滴加实施例7中制备的制剂(a) ~（e)，滴加1次~4次，自最后一次滴加巴豆油起2~6小时后屠杀大鼠，沿着眼睑缘将浮肿 部位切下，测定其重量。计算制剂滴眼群相对于生理盐水滴眼群的浮肿重量减少比例，从而 评价了对结膜浮肿的抑制效果。
[0221] (7)通过向兔的玻璃体注入牛血清白蛋白而制作了葡萄膜炎(一次葡萄膜炎）。进 一步，在该炎症消退之后（牛血清白蛋白的玻璃体注入27~29天后），再次由耳静脉注入牛 血清白蛋白，使葡萄膜炎复发(二次葡萄膜炎）。对于一次葡萄膜炎和二次葡萄膜炎，以30分 钟~数小时间隔向兔眼滴加实施例7中制备的制剂(a)~(e)，每天滴加1次~6次，基于评分 标准而对生理盐水滴眼群和制剂给药组的外眼部炎症症状(角膜混浊、眼睑结膜充血、眼睑 结膜浮肿、眼球结膜充血)和内眼部炎症症状(虹膜充血、虹膜形态的变化、前房混浊)进行 评分，并作为葡萄膜炎的指标。
[0222] 可以认为，与作为阳性对照的Azasite(注册商标)相比，纳米化克拉霉素悬浮剂的 基于目测的眼刺激性(角膜混浊、眼睑结膜充血、眼睑结膜浮肿、眼球结膜充血)为同等或更 低。另外可以认为，与作为阳性对照的Azasite(注册商标)相比，纳米化克拉霉素悬浮剂的 抗炎症效果为同等或其以上。
[0223 ](实施例10)纳米化克拉霉素悬浮剂的稳定性试验
[0224] 在容量9mL的螺纹瓶中量取6~8g的实施例7(1)中制作的纳米化克拉霉素悬浮剂 (克拉霉素浓度〇. 3 %及1.0 % )，分别在设定为5 °C、25 °C、40 °C的恒温恒湿器中静置，持续14 天进行了稳定性试验。在7天后和14天后利用高效液相色谱法(HPLC)对克拉霉素的浓度进 行定量，求出以刚制备制剂之后的克拉霉素浓度为1 〇〇 %时的残存率，并由此对稳定性进行 了评价。HPLC的分析条件如下所述。
[0225] 装置：Waters alliance
[0226] 色谱柱：Inertsi I ODS 4.6mm X 150mm
[0227] 柱温：50°C
[0228] 洗脱液：20mM KH2P04/CH3CN(8:2)
[0229] 检测波长:210nm
[0230] 稳定性试验的结果如表5所示。克拉霉素在5°C、25°C及40°C的各温度下，经14天而 未确认到分解，是稳定的。
[0231] [表 5]
[0233] (实施例11)纳米化克拉霉素悬浮剂的眼内动态试验
[0234] 对兔眼按照5分钟~30分钟的间隔滴加实施例7 (1)中制作的（b)纳米化克拉霉素 悬浮剂(克拉霉素浓度〇. 3 % )、（ c)纳米化克拉霉素悬浮剂(克拉霉素浓度1.0 % )、（ d)克拉 霉素原粉悬浮剂(克拉霉素浓度1. 〇 % )、或(e)Azasite (注册商标）（阳性对照）（阿奇霉素浓 度0.3%)，滴加1次~10次，利用HPLC或LC/MS/MS等对滴加30分钟、1、2、4、6小时后的外眼部 各组织(结膜、角膜、房水)中的克拉霉素浓度进行了测定。
[0235] 在纳米化克拉霉素悬浮剂中，结膜、角膜及房水中的克拉霉素浓度高于克拉霉素 原粉悬浮剂的情况，可以认为，与作为阳性对照的Azasite的情况相比为同等或更高。
[0236] (实施例12)克拉霉素粉碎Dough (面团）的制作
[0237] 在0.5L TRHOX(井上制作所制）中进料平均粒径10，370nm的克拉霉素(熔点：217_ 220°C;Assia Chemical Industries Ltd. )30g、甘露糖醇(和光纯药工业公司制)90g、聚乙 烯吡咯烷酮K25(和光纯药工业公司制）9g、及氢化大豆卵磷脂PH0SPH0LIP0N 90H (H.Holstein公司制）12g，混合至均一之后，注入甘油23.6g，使内容物保持为生面团状，于 10 °C进行了 6小时粉碎。所得混炼面团的回收量为145.8g(回收率88.5 % )。
[0238] 向所得混炼面团IOOmg中加入0· l%HC0_60(Nihon Surfactant kogyo公司制）3g， 使用浴槽型超声波分散机(型号:VS-100III、AS〇ne公司制)进行了数分钟分散处理。利用粒 度分布测定装