用于口服药物递送的新型核-壳纳米颗粒的制作方法
【专利说明】用于口服药物递送的新型核-亮纳米颗粒 发明领域
[0001 ]本发明一般地设及药物递送技术，并且更具体地设及口服纳米颗粒药物递送系 统，包括用于使用疏水性的不溶于水的蛋白制备运样的系统的方法，所述纳米颗粒可W包 括谷醇溶蛋白W产生口服药物递送系统。
[0002] 背景信息
[0003] 尽管处方儿科药物的制药市场估计为每年430亿美元，儿科友好的制剂的缺乏导 致40%的世界人口处于不适当给药、非依从性、毒性及难于使用大部分药物的升高的风险 中。例如，全反式视黄酸(ATRA)被用于治疗儿童急性早幼粒细胞性白血病，然而，现有的制 剂具有差的化学稳定性、差的水溶性及差的口服生物利用度的问题。
[0004] 考虑到多于330万的HIV患者是儿童，大多数儿科HIV患者没有使用适当的药物治 疗。主要在发达国家中，由于母婴传播及母乳喂养，儿科HIV非常难W消除。最近的世界卫生 大会(WHA)已经认识到儿科患者的权利，在"使药物成为儿童所需规格(Make medicines chi Id S i Ze r的全球性保护下促进对安全且有效的药物的需求。
[0005] 沙奎那韦是高度亲脂的蛋白酶抑制剂，其在HIV的治疗中使用并被归类在生物医 药分类系统(Bio地armaceutic Classif ication System,BCS)的IV类中。然而，沙奎那韦具 有从味苦到差的溶解性W及渗透性的问题，导致约(0.7-4%)的低生物利用度。
[0006] 玉米醇溶蛋白，一种可W从玉米或玉蜀泰分离的植物蛋白，属于谷醇溶蛋白家族， 所述谷醇溶蛋白家族包含大量非极性氨基酸，诸如脯氨酸、谷氨酷胺和天冬酷胺。玉米醇溶 蛋白是无气味、无毒、可生物分解并且不溶于水的，并因此是对于许多应用的引人注目的成 分，所述应用包括在制药和医疗产业中的使用。在制药产业中，玉米醇溶蛋白已经被使用， 例如，用于膜包衣材料和用于形成颗粒系统，诸如微米颗粒或纳米颗粒(美国专利号5,679， 377(Bernstein等），通过引用将其完整并入本文;Liu等，Biomaterials 26(2005)109-115; Lopez和Murdan,J Microencapsulation 23(2006)303-314;Zhong等，Food Biophysics 3 (2008)186-190;化rris等，J Agric Food Chemistry 53(2005)4788-4792)。
[0007] 可将颗粒药物递送系统用于掩味、提高药物稳定性和药物溶解度。易于药物施用、 安全性W及制剂赋形剂的适口性是剂型特别是用于儿科使用的剂型的最重要的决定因素。 [000引通常，对于儿科药物，挑战仍然存在于安全性和儿科制剂中使用的赋形剂的适口 性、易于施用及患者的依从性、特殊储存条件、与食物和饮料的相容性、W及考虑到儿科GI 生理学设计儿科药物制剂。
[0009] 因此，需要用于制备玉米醇溶蛋白颗粒的新方法W使得颗粒可用于口服施用。还 需要新的治疗载体用于W安全且有效的方式进行重要疗法的递送，W便克服与儿科口服施 用相关的挑战。
[0010] 发明概述
[0011] 使用食品级聚合物，申请人已经开发了一种用于儿科患者的口服纳米颗粒药物递 送系统。为此目的，使用例如玉米醇溶蛋白（一种玉米蛋白质)作为疏水性核W及酪蛋白（一 种乳蛋白）或球状糖蛋白诸如乳铁蛋白作为壳，开发了纳米颗粒。
[0012] 在实施方案中，公开了 一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含至少两种蛋白，其中第一 蛋白是谷醇溶蛋白，并且第二蛋白是e-酪蛋白或乳铁蛋白，且其中纳米颗粒表现出核-壳结 构。
[0013] 在一方面，谷醇溶蛋白包括白玉米醇溶蛋白、黄玉米醇溶蛋白、麦醇溶蛋白 (gliadin)、大麦醇溶蛋白化ordein)或高梁醇溶蛋白。
[0014] 在另一方面，纳米颗粒还可W包含货物分子，其中所述货物分子是II类或IV类药 物。在一个相关的方面，货物分子包括制药材料、治疗材料、诊断剂、农业材料、免疫增强剂、 生物活性剂及其组合。
[0015] 在一方面，货物分子包括视黄醇、13-反式-视黄酸（维甲酸）或全反式视黄酸 (ATRA)、13-顺式-视黄酸（异维甲酸）、9-顺式-视黄酸（阿利维甲酸）、视黄醒、阿维A醋 (e化etnate)、阿维A酸（aci化etin)、a-胡萝h素、0-胡萝h素、丫-胡萝h素、e-隐黄素、叶黄 素、玉米黄质及其组合。
[0016] 在另一方面，货物分子是沙奎那韦。
[0017] 在一方面，纳米颗粒通过喷雾干燥法或相分离法形成。
[0018] 在另一方面，纳米颗粒还包含货物，其中所述货物是细胞、蛋白质、核酸、抗体、生 长因子或其组合。在一个相关的方面，所述货物被吸附至纳米颗粒的表面。
[0019] 在一方面，纳米颗粒是交联的，其中交联剂包括京尼平。
[0020] 在另一方面，纳米颗粒的谷醇溶蛋白是PEG化的。
[0021] 在一方面，纳米颗粒为干燥、自由流动、无色或白色、不吸湿的粉末的形式。在另一 方面，纳米颗粒包含稀释剂、赋形剂或载体W形成药学上可接受的组合物。在一个相关的方 面，组合物是口服制剂并任选地被包含在食物或饮料中。
[0022] 在一个实施方案中，公开了一种试剂盒，所述试剂盒包括:冻干的粉末或分散体， 所述冻干的粉末或分散体包含如本文公开的纳米颗粒;一种或更多种缓冲液;一种或更多 种标记物;一种或更多种容器;及说明手册，其中说明手册公开了如何使用冻干的粉末。
[0023] 在另一个实施方案中，公开了一种制备纳米颗粒的方法，所述方法包括:在水醇溶 剂中溶解谷醇溶蛋白W形成有机相;将有机相添加到缓冲液中W形成沉淀物，其中缓冲液 包含巧樣酸盐阴离子、另外的蛋白、任选地至少一种货物分子、或任选地稳定化分子，所述 稳定化分子包括树胶、多糖或果胶或其组合;对所述沉淀物进行声处理;离屯、剩余的水相W 形成团块;洗涂所述团块，任选地添加冷冻保护剂；W及冻干所述团块，其中得到的纳米颗 粒具有在约90nm到约300nm之间的颗粒尺寸。
[0024] 在一方面，另外的蛋白是0-酪蛋白或乳铁蛋白并且所述多糖是右旋糖酢或阿拉伯 树胶。
[0025] 在一个实施方案中，公开了一种制备纳米颗粒的方法，所述方法包括:在包含缓冲 液的水醇溶剂中溶解谷醇溶蛋白和第二蛋白W形成沉淀物，其中所述缓冲液包含巧樣酸盐 阴离子;对所述沉淀物进行声处理W形成声处理物;任选地将一种或更多种货物分子添加 到声处理物中W形成混合物;将声处理物或混合物装载到喷雾干燥器中，将所述声处理物 或混合物喷雾干燥进入收集筒中W形成喷雾干燥的材料；W及从收集筒中收集喷雾干燥的 材料，其中得到的纳米颗粒具有在小于约90nm到约SOOnm之间的颗粒尺寸。
[0026] 在一个相关的方面，其中所述另外的蛋白是0-酪蛋白或乳铁蛋白。
[0027] 在一个实施方案中，公开了如所描述的纳米颗粒在制备用于治疗需要其的受试者 中的素乱的药物中的用途，其中所述素乱包括急性髓系白血病、早幼粒细胞性白血病、神经 母细胞瘤和儿科HIV。
[0028] 在另一个实施方案中，公开了一种治疗素乱的方法，所述方法包括对需要其的受 试者口服施用如本文描述的纳米颗粒，其中所述素乱包括急性髓系白血病、早幼粒细胞性 白血病、神经母细胞瘤和儿科HIV。
[0029] 附图简述
[0030] W下附图构成本说明书的一部分并被包括W进一步说明本发明的某些实施方案 或多个方面。在一些实例中，可通过参考附图结合本文展示的详细描述而使本发明的实施 方案被最好地理解。说明书和附图可凸显本发明的某个特定实施例或某个方面，但是，本领 域技术人员将理解实施例或方面的部分可W与本发明的其他实施例或方面结合使用。
[0031] 图1图示了用于制备通过乳铁蛋白稳定化的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的步骤。
[0032] 图2通过流程图的方式图示了用于根据一个实施方案制备京尼平交联的玉米醇溶 蛋白-酪蛋白纳米颗粒的一般步骤。
[0033] 图3图示了喷雾干燥法的流程图。
[0034] 图4示出了 [3HhATRA从ZLF纳米颗粒的体外释放数据的图。
[0035] 图5示出了在食物基质、随后在SGF和SIF中的SQ释放的图。(A)乳汁预施用和(B)苹 果汁预施用。
[0036] 图6示出了显示SQ(沙奎那韦）、ZC(玉米醇溶蛋白-酪蛋白）、ZLF(玉米醇溶蛋白-乳 铁蛋白）和PZ(聚乙二醇）随时间推移的化PP值的图。
[0037] 图7示出了显示ZC(玉米醇溶蛋白-酪蛋白）JLF(玉米醇溶蛋白-乳铁蛋白WPPZ (聚乙二醇）随时间推移的化PP值的图。
[0038] 图8示出了纳米颗粒对TE邸的影响。
[0039] 图9示出了细胞摄取作为时间(A)和溫度(B)的函数的图。
[0040] 图10示出了来自竞争性抑制测定的数据。
[0041 ] 图11示出了在化Co-2细胞中的P-甜抑制。
[0042]图12示出了在口服施用玉米醇溶蛋白-酪蛋白（ZC)纳米颗粒、玉米醇溶蛋白-乳铁 蛋白（ZLF)纳米颗粒和PEG-玉米醇溶蛋白（PZ)纳米颗粒中装载的沙奎那韦后，大鼠中的沙 奎那韦的血浆浓度曲线。来自基于玉米醇溶蛋白的纳米载体的沙奎那韦的生物利用度被提 高。如可从曲线看出的，在血浆中药物缓慢地释放且血浆浓度被保持48小时。
[00创发明详述
[0044] 口服途径是对于儿童群体最普遍的递送药物方式。但是，儿童友好型制剂的缺乏 导致40%的世界人口处于升高的不适当给药的风险且难于获得大多数API (活性药物成 分）。为此目的，天然的食品级聚合物(例如，蛋白质)是有前途的药物递送载体。在生物聚合 物中，来自玉米的球状疏水蛋白玉米醇溶蛋白W及来自乳汁的线性两亲性蛋白e-酪蛋白被 广泛地用作食品和制药应用中的成分。运些聚合物作为GRAS材料是可生物分解、广泛可得 的并被US-抑A批准。在实施方案中，公开了用于儿科口服药物递送应用的使用玉米醇溶蛋 白和酪蛋白的核-壳纳米颗粒。
[0045] 在实施方案中，本公开内容的基于蛋白的纳米颗粒可W有效地装载BCS II/IV类 药物并实现运些药物到需要其的受试者的成功的口服递送。如在本领域中熟知的，BCS II 类药物是具有高渗透性、低溶解性的那些药物;BCS IV类药物是具有低渗透性和低溶解性 的那些药物。
[0046] BCS II类药物包括，但不限于，胺舰酬，阿托伐他汀，阿奇霉素、卡马西平、卡维地 洛、氯丙嗦、西沙必利、环丙沙星、环抱菌素、达那挫、氨苯讽、双氯芬酸、二氣尼柳、地高辛、 红霉素、氣比洛芬、格列化嗦、格列本脈、灰黄霉素、布洛芬、巧地那韦、吗I噪美辛、伊曲康挫、 酬康挫、兰索拉挫I、洛伐他汀、甲苯咪挫、糞普生、奈非那韦、氧氣沙星、奥沙普秦、非那化 晚、苯妥英、化罗昔康、雷洛昔芬、利托那韦、沙奎那韦、西罗莫司、螺内醋、他克莫司、他林洛 尔、他莫昔芬和特非那定。
[0047] BCS IV类药物包括，但不限于，两性霉素、氯嚷酬、氯嚷嗦、粘菌素、环丙沙星、巧塞 米、氨氯嚷嗦、甲苯咪挫、甲氨噪岭、新霉素。
[0048] 在实施方案中，用于儿童中的神经母细胞瘤的药物全反式视黄酸(ATRA)可与所述 纳米颗粒组合，运种结合克服了与低化学稳定性、溶解度和口服生物可利用性有关的问题。
[0049] 在实施方案中，本公开内容的基于蛋白的纳米颗粒具有核-壳结构。在一方面，所 述基于蛋白的纳米颗粒可W通过相分离来形成。在相关方面，核-壳颗粒由于构成纳米颗粒 的蛋白之间的疏水性的不同而得W形成。
[0050] 在实施方案中，本公开内容的基于蛋白的纳米颗粒可W通过喷雾干燥来制备。在 相关方面，可W使用的喷雾干燥器是Nano Spray Dryer B-90,BiiCHI(脚CHI Labo;rtechnik AG,Switzerland)。
[0051] 在实施方案中，喷雾比率可W是100%、约50%或约20%。在相关方面，氮流动速率 可W是约90L/min、约120L/min或约150L/min。在另一方面，入口溫度可W是约70°C、约90°C 或约120°C。
[0052] 在实施方案中，喷雾干燥方法包括约155°C的入口溫度、约90L/min的氮流动速率 和约化m的喷雾网尺寸和约100%的喷雾率。本文公开了使用玉米蛋白（玉米醇溶蛋白）作为 疏水性核并且乳蛋白（酪蛋白）作为壳的纳米颗粒。
[0053] 在另一方面，蛋白成分包括选自由W下组成的组的谷醇溶蛋白：玉米醇溶蛋白、麦 醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白或高梁醇溶蛋白。在相关方面，谷醇溶蛋白是玉米醇溶蛋白。在另 一相关方面，玉米醇溶蛋白与e酪蛋白或乳铁蛋白或聚乙二醇(PEG)组合，其中PEG为从约 SkDa 到约 20kDa。
[0054] 在实施方案中，玉米醇溶蛋白/0酪蛋白或玉米醇溶蛋白/乳铁蛋白W约1:1或约1: 2或约1:3或约1:4或约1:5的比率存在。在一方面，纳米颗粒在包含巧樣酸盐缓冲剂、具有约 6.8到约7.4的pH的溶液中来制备。在相关方面，溶液可W包含水醇相，其中醇相是在约70 % 到约90 %之间的醇。
[0055] 在实施方案中，颗粒具有纳米范围的尺寸，具有窄的多分散性。在一方面，纳米颗 粒的平均尺寸在约50到约70nm、约70到约90nm、约90到约115nm、约115到约150nm、约150到 约200nm、约200到约300nm、约300到约350nm、约300到约500nm或约500到约900nm之间。 [0化6] 在另一方面，纳米颗粒表现出约71.06 %到约90 %的封装效率，和约1.17 %到约 9 %的装载效率。在相关方面，颗粒表现出平滑且球形的表面。
[0057]在另一方面，基于蛋白的纳米颗粒包含稳定剂，所述稳定剂包括但不限于PEG、树 胶和果胶，其中此类稳定剂在喷雾干燥或相分离中与蛋白组合。
[0058] 在实施方案中，可W优化如本文公开的方法W达到期望的颗粒尺寸、PDI和高封装 效率。在相关方面，优化可W包括使用33个Box-Be化en设计。在相关方面，使用包括二次方 程式的模型优化的纳米颗粒设计产生基于观察值和预测值优化的制剂。例如，对于玉米醇 溶蛋白-e酪蛋白，一个如此优化的设计包含1:2的比率的玉米醇溶蛋白-0酪蛋白；其中使用 巧樣酸盐缓冲剂使水相的pH是7.4，且水醇相的％是70%。
[0059] 在实施方案中，可W将纳米颗粒制剂用作ATRA的口服控制药物递送系统。在相关 方面中，在本公开内容的装载ATRA的纳米颗粒中，ATRA的稳定性增加。在另一个方面，纳米 颗粒的摄取可W在体外使用细胞来进行，所述细胞包括但不限于Caco-2极性细胞。另外，可 W在包括大鼠的合适的动物模型中利用原位灌注分析和节段肠摄取来证实来自此类研究 的结果。此外，可W使用所述动物来进行药代动力学分析。
[0060] 在实施方案中，可W将纳米颗粒制剂用作沙奎那韦的口服控制药物递送系统。
[0061] 申请人已通过将视黄醇封装在新型的基于蛋白的纳米颗粒中用于口服剂量应用 (包括儿童使用)成功地解决了视黄醇的口服递送问题。
[0062] 如本文描述的，已经从玉米蛋白玉米醇溶蛋白和来自乳汁的线性两亲性蛋白0-酪 蛋白开发出了新型纳米载体。因为玉米醇溶蛋白是疏水的，所W它可被用来如本文描述的 将疏水的类视黄醇封装在纳米颗粒内部，且如本文所描述的玉米醇溶蛋白-e-酪蛋白纳米 颗粒可用来封装疏水的类视黄醇，W提供水可移除的类视黄醇制剂。
[0063] 纳米颗粒为选择视黄醇制剂用于多种应用提供了灵活性。申请人已经制备出装载 视黄醇的玉米醇溶蛋白-酪蛋白纳米颗粒，其尺寸范围为约IOOnm到约300nm，具有76-100 % 的封装效率。装载视黄醇的纳米颗粒尺寸范围为180-220nm，具有79-91 %的封装效率。视黄 醇在纳米载体中的封装得到了口服递送所必需的水可分散性制剂。
[0064] 玉米醇溶蛋白-0-酪蛋白纳米颗粒显著地提高了视黄醇的固体状态和液体状态对 抗潮湿和光引起的降解的稳定性。视黄醇从玉米醇溶蛋白-e-酪蛋白纳米颗粒的释放持续 长达一周。
[0065] 纳米载体的独特方面是纳米颗粒解决视黄醇的口服递送的多个市场挑战的能力， 包括提供了施用便利和患者依从性、避免特殊胆存条件、提供了与食物和饮料的兼容性，W 及提供了考虑儿童GI生理的儿科药物制剂。
[0066] 在封装在纳米颗粒中之后，视黄醇的水可分散性显著提高。视黄醇可持续从玉米 醇溶蛋白-e-酪蛋白纳米颗粒释放导致应用的剂量下降且频率降低。将视黄醇封装在玉米 醇溶蛋白-e酪蛋白纳米颗粒中显著地增加了视黄醇制剂的货架寿命。玉米醇溶蛋白-e-酪 蛋白纳米颗粒增加了视黄醇在固体和半固体制剂中的可流动性和可分散性。