br>[0206] 通过在DSC Q200(TA Instruments, Inc.USA)中进行DSC来确定制剂中药物的物理 状态。获得玉米醇溶蛋白空白、装载ATRA的颗粒和纯ATRA的DSC热谱图（未示出）。将精确称 量的样品（5mg)卷放入侣卷边锅(T Zero Lid#T100819)并在氮气氛(流速20ml/min)下WlO °C/min的速率从23 °C加热到300 °C。将空白侣室用作参考。利用TA通用分析软件（TA Ins化uments Inc,USA)处理热谱图（未示出）。将从空白制剂、纯药物和装载药物的制剂获 得的热谱图彼此比较，W确定制剂中的ATRA的物理状态。
[0207] 实施例2.溶剂的影响
[0208] 为了利用纳米喷雾干燥器鉴定合适的溶剂并稳定纳米颗粒，使用了模型疏水化合 物(姜黄素)作为玉米醇溶蛋白纳米颗粒中的封装剂(encapsulant)。
[0209] 如在表4中示出的，多种喷雾干燥溶剂对玉米醇溶蛋白纳米颗粒具有不同的影响， 包括对尺寸、PDI和C电势的影响。
[0210] 表4.多种溶剂对纳米颗粒特征的影响
[0212] 在喷雾干燥之前，对于玉米醇溶蛋白的溶解，首先考虑选择有机溶剂或有机溶剂 的混合物。若干种有机混合物被用来进行喷雾过程。对于40ml的最终体积，最终的有机溶 剂/水的比是3:2。
[0213] 实施例3.稳定剂的影响
[0214] 如在表5中示出的，在喷雾干燥中使用的多种稳定剂对玉米醇溶蛋白纳米颗粒具 有不同的影响，包括对尺寸、PDI、C电势和聚集特征的影响。
[0215] 表5.稳定剂对纳米颗粒特征的影响
[0217] SLS，十二烷基硫酸钢;PVP，聚乙締邮咯烧酬;PSA，聚唾液酸。
[021引 W60%化OH的近似体积添加1:1的比的玉米醇溶蛋白和稳定剂（即，在有机溶液中 材料基质的总浓度保持在1%不变），并随后在室溫下进行水浴声处理直到所有成分完全溶 解。
[0219] 实施例4.喷雾干燥的颗粒、理化表征
[0220] 使用Malvern Ze1:asizer S3600(Malvern Inshuments Inc. ,Southborough,MA) 通过动态激光散射来确定颗粒尺寸、分布和C电势的表征。参见，例如，表6和图。
[0221 ]对于喷雾干燥的0酪蛋白纳米颗粒，产生如下数据： 义寸(d.nm) 强展％ 宽度(d.nm) Z 平均值(d.nm): 91.46 峰 I: 102.0 98.2 40.37
[0222] :化 179 峰 2: 4813 1.8 718.4 截距：0.961 峰 3: 0.000 0.0 0.000 得到的质量：良好
[0223] 表6.喷雾干燥的ZC纳米颗粒的性质
[0225] ZC，玉米醇溶蛋白酪蛋白纳米颗粒;ATRA，全反式视黄酸。
[0226] 实施例5.具有天然树胶或多糖的喷雾干燥的玉米醇溶蛋白-酪蛋白（ZC)纳米颗 粒.
[0227] 将果胶和树胶添加到材料基质(玉米醇溶蛋白和酪蛋白），W便在喷雾溶液中的总 浓度为约l%wt。如W上提到的进行喷雾干燥过程。为了调查具有果胶和树胶的ZC纳米颗粒 的稳定性，在酸性抑(1.5)中W及在水(中性抑)中测量尺寸、PD巧K电势。参见表7、8和9。 [02%]表7.具有阿拉伯树胶的喷雾干燥的ZC纳米颗粒(ZCG)
[0230]表8.具有高甲氧基果胶(HMP)的喷雾干燥的ZC纳米颗粒
[0232]表9.具有低甲氧基果胶(LMP)的喷雾干燥的ZC纳米颗粒
[0234] 实施例6.喷雾干燥的PEG-玉米醇溶蛋白纳米颗粒的表征，包括与玉米醇溶蛋白-酪蛋白纳米颗粒的比较.
[0235] 表10显示了在喷雾干燥过程和无喷雾干燥过程之间，具有多种分子量（5-201d)a) 的PEG的多种聚乙二醇化的玉米醇溶蛋白组合的尺寸、PDI和C电势。
[0236] 表10. PEG分子量对纳米颗粒特征的影响
[0239]还检查了物理混合物(参见表11)。
[0240]表11.在喷雾干燥条件下阳G和玉米醇溶蛋白的物理混合物
[0242] 如可在表10和11之间看出的，PEG化的玉米醇溶蛋白具有与简单的PEG+玉米醇溶 蛋白混合物完全不同的性质。
[0243] 表12证明了多种玉米醇溶蛋白纳米颗粒组合物在模拟胃液(SGF，pHl.3)中的稳定 性。
[0244] 表12SGF对多种纳米颗粒的特征的稳定性的影响
[0246] ZCG，玉米醇溶蛋白-酪蛋白阿拉伯树胶纳米颗粒。
[0247] 装载ATRA的玉米醇溶蛋白酪蛋白纳米颗粒的特征可见于表13(通过相分离法制 备)和14(通过喷雾干燥法制备）。
[0248] 表13.相分离法制品
[0250] 表14.喷雾干燥法制品
[0252]表15显示出喷雾干燥对使用了多种ATRA浓度的装载ATRA的玉米醇溶蛋白-PEG纳 米颗粒的影响。
[0巧3] 表15 .ATRA浓度对纳米颗粒特征的影响
[0255] 如可预期的，趋势表明随ATRA浓度增加，尺寸和PDI增加，而C电势降低，表明至少 对于玉米醇溶蛋白-PEG而言，随着ATRA浓度增加，可存在聚集的可预见的减少。
[0256] 在表16中显示了 ATRA的装载和封装效率作为相分离的玉米醇溶蛋白-酪蛋白和喷 雾干燥的阳G玉米醇溶蛋白的函数(利用HPLC进行分析）。
[0257] 表16.使用ATRA W及ZC纳米颗粒和玉米醇溶蛋白-PEG纳米颗粒装载和封装的效 率.
[0259] 结果指示了装载ATRA的玉米醇溶蛋白-酪蛋白纳米颗粒在胆存条件中是稳定的， 且持续多达60天在颗粒尺寸或ATRA含量上没有显著的变化。另外，ZC纳米颗粒似乎表现出 比玉米醇溶蛋白-PEG高的装载效率和封装效率。在图4中显示了运些制剂的体外释放数据。
[0260] 实施例7. ZC纳米颗粒和沙奎那韦(SQ)组合.
[0261] 表17显示了通过相分离法制备的装载沙奎那韦（SQ)的玉米醇溶蛋白酪蛋白纳米 颗粒的特征。
[0262] 表17.通过相分离法制备的包含SQ的纳米颗粒的特征
[0265] 表18显示了通过HPLC得到的ZC纳米颗粒的SQ含量和封装效率。
[0266] 表18. SQ封装效率和装载效率.
[0268] 实施例8.用于玉米醇溶蛋白-乳铁蛋白纳米颗粒的材料和方法.
[0269] 相分离方法
[0270] 将0.2 % (w/v)牛乳铁蛋白（Fonterra Cooperat ive Gro叩，Auckland , New Zealand)溶解在0.1 M巧樣酸盐缓冲溶液中。将15mg来自玉米的白玉米醇溶蛋白（F6000级） 溶解在2ml的90 %化OH中。W约0.1 mg到Img的浓度范围将沙奎那韦从胆存溶液添加到该乙 醇溶液。在探头式声处理下将有机相逐滴添加到包含乳铁蛋白的0.1 M巧樣酸盐缓冲溶液。 将探头式声处理设定为38%振幅，持续10分钟（10秒开和1秒关循环），并W超过500kJ的能 量声处理。将玉米醇溶蛋白-乳铁蛋白分散体放置在磁揽拌器(300rpm)下，持续4小时，W使 化OH蒸发。此外，利用Millipore离屯、过滤器(30k丽CO)将纳米颗粒分离，并使用移液管用 去离子水洗涂数次。任选地，添加冷冻保护剂(海藻糖)并随后将混合物放置于-80°C，之后 在-105°C/100mTorr真空冻干48小时。最后，将制剂胆存在干燥器中的封闭小瓶中，直到进 一步使用。
[0271 ]京尼平交联的玉米醇溶蛋白-乳铁蛋白（ZLF)纳米颗粒.
[0272] 通过将作为交联剂的京尼平(0.5-10mg/ml)添加到有机相化tOH)来使化F纳米颗 粒交联，然后进行如W上概括的步骤。随后，如W上概括的纯化、洗涂并冻干得到的交联的 纳米颗粒。
[0273] 实施例9. ZLF纳米颗粒的物理化学表征
[0274] 使用Malvern Ze1:asize;r-S3600(Malvern Inshuments Inc. ,Southborough,MA) 通过动态激光散射来确定颗粒尺寸、分布和C电势的表征。
[02对结果
[0276] 尺寸(dninj 强度。/〇 宽度(d.nm) Z-平均值(d.nm): 194.9 峰 I: 22!. I 100.0 74.69 Pdl: 0.I22 峰 2; 0.000 0.0 0.000 截距：0.929 峰 3: 0.000 0.0 0.000 结果质量:良好
[027引表19.比对ZLF纳米颗粒特征的影响
[0280] 表20.来源对ZLF纳米颗粒特征的影响
[0282]表21.缓冲液对ZLF纳米颗粒特征的影响
[0284]表22.装载ATRA的ALF纳米颗粒的特征
[0286] 装载沙奎那韦的ZLF纳米颗粒
[0287] 表23.装载SQ的ALF纳米颗粒的特征
[0289] 实施例10.形态学分析
[0290] 原子力显微术研究
[0291] 将ImL蒸馈水中的约Img纳米颗粒用于AFM分析。使用聚乙締胺包被的玻璃盖片将 IOOyl分散体置于新切割的云母表面并惊干过夜。在Iwii的扫描面积中收集AFM图像。
[0292] 透射电子显微术(TEM):
[0293] 利用Department of Chemistry ChurchiII-Haines Laboratories ,University of South Dakota,Vermillion的Tecnai Sprint G2 Twin化EI公司）透射电子显微镜来获 取图像。W120 kV的加速电压操作设备。通过将稀释的化F纳米颗粒分散体滴加到碳包被的 200目铜网格化Iectron Microscopy Sciences)并允许蒸发过夜来制备纳米颗粒样品。利 用与TEM偶联的SC200 CCD相机记录所有的电子显微照片。利用DitialMicrogra地软件进行 图像分析。TEM图像显示ZLF纳米颗粒为球形，尺寸为约100 nm，具有核-壳特征。比例尺是50 nm(未示出）。
[0294] 表24. pH对ZLF纳米颗粒尺寸和多分散性指数的影响.
[0巧6] C电势图，C电势在从pH 2到4是高度正的（+30 mV)，在pH 5到6是中等正的（+20 mV) "ALF纳米颗粒跨所检查的全部抑范围对聚集是稳定的。然而不被理论所束缚，运可归因 于壳空间排斥力，由于附连到乳铁蛋白的多肤链的亲水性碳水化合物基团W及与e-酪蛋白 相比LF的较高的分子量，壳空间排斥力是典型的游移(linger)范围。
[0297]表25.离子强度对ZLF纳米颗粒尺寸、分布和C电势的影响.
[0299]从表25来看，不存在由于离子强度的变化引起的颗粒尺寸的改变。但是，随着盐浓 度增加，观察到电荷从高度正的逆转到轻微正的。然而不被理论所束缚，该数据表明可能存 在阴离子氯离子与ZLF纳米颗粒的壳上的带正电荷的基团的一些结合。
[0300] 在模拟胃液中重构的制剂显示出一系列溶液特征。例如，玉米醇溶蛋白-乙醇分散 体显示出乳状聚集物，而玉米醇溶蛋白-酪蛋白（ZC)纳米颗粒显示出轻微的浑浊，具有黛青 色的微光，且ZLF显示出轻微浑浊，带有微红色的微光。
[0301] 实施例11.药物含量和封装效率.
[0302] 通过HPLC方法测量ATRA或沙奎那韦含量和封装效率。简而言之，将4mg装载药物的 ZLF纳米颗粒分散在Iml DI水中，并随后W1400巧m离屯、lOmin。丢弃上清液并保留团块用于 分析。将团块小屯、地分散在50%化0H/CB中，并进行探头式声处理5min，之后水浴声处理W 确保完全溶解。对于ATRA或沙奎那韦的定量，在同一天产生标准曲线。
[030引对于装载尼罗红（Sigma，St. Loui S ,MO)的ZLF颗粒，在分光光度计（例如， SpectromaxMS ,Molecular Devices ,Sunnydale ,CA)中 W559nm和62化m的激发波长和发射 波长测量尼罗红的巧光。
[0304] 对于ATRA的色谱条件如下：
[030引柱：C-18柱，1OOA,加m,4.6mm X 150mm;流动相：乙腊（1.13ml/min)-l %w/v乙酸 锭缓冲液(0.12ml/min);检测波长:342nm;注射体积:5化1;运行时间：lOmin。
[0306] 对于沙奎那韦的色谱条件如下：
[0307] 柱:C-18柱，3.5um,4.6mm X 75mm;流动相：乙腊(0.48ml/min)-0.7%w/v乙酸锭缓 冲液(0.32/min);检测波长:240nm;注射体积:2化1;运行时间：8min。
[0308] 表26.封装尼罗红、ATRA和SQ的ZLF纳米颗粒的特征
[0310] ATRA:全反式视黄酸。
[0311] 对于与玉米醇溶蛋白-PEG的封装和装载效率的比较，参见图）。
[0312] 实施例12.差示扫描量热法(DSC).
[0313] 利用DSC Q200(TA Instruments,Inc.USA)通过DSC来确定制剂中沙奎那韦的物理 状态。将精确称量的样品（5mg)卷放入侣卷边锅(T Zero Lid#T100819)并在氮气氛(流速 20ml/min)下WlOtVmin的速率从23°C加热到300°C。将空白侣室用作参考。使用TA通用分 析软件(TA Ins化皿ents Inc,USA)处理热谱图（未示出）。
[0314] 实施例13.体外药物释放研究.
[0315] 在模拟胃液和模拟肠液中通过测量随着释放介质条件改变的同时，纳米颗粒中剩 余的药物的浓度(试管法)来评价药物释放动力学。简而言之，将IOmg装载药物的ZLF纳米颗 粒悬浮在包含具有酶的释放介质的2ml Eppendorf管中。利用Accumet抑仪调节释放介质 的pH。由包含特定比的牛横胆酸钢和卵憐脂的模拟肠液(SIF)粉末(Biorelevant，化oydon, Surrey, UK)制备"进食"状态的模拟胃肠液（FeSSGIF)和"空腹"状态的模拟胃肠液 (FaSSGIF)。在不同的时间点，采集两个样品，并在14,000巧m离屯、lOmin。利用Iml移液管小 屯、地移除上清液，并将剩余的团块溶解在50 %的化OH中用于HPLC分析。如本文之前描述的 利用HPLC来确定药物的浓度。
[0316] 实施例14.在普通食物和饮料中的体外药物释放研究
[0317] 对于ATRA在模拟GIT液W及普通食物和饮料中的释放，使用3H-ATRA定量ATRA。进 行并行采样W模拟进食和空腹状态。简而言之，将IOmg装载ATRA的ZLF纳米颗粒悬浮在包含 释放介质、苹果汁或乳汁（3 %脂肪）的2ml Eppendo计管中。将管置于37 °C、600巧m的摇床 中。在不同的时间点，将样品移出，并在14，000巧m离屯、IOmin。利用Iml移液管小屯、地移除上 清液，并将剩余的团块溶解在50%的EtOH中。利用放射化学分析来分析ATRA含量(参见图 4)。
[031引对于沙奎那韦在普通食物和饮料中的释放，通过提取W及如之前描述的利用HPLC 分析的定量来进行分析。简而言之，对装载沙奎那韦的化F纳米颗粒离屯、，并将得到的团块 在-80°C冷冻并冻干。随后用50%化OH提取冻干的材料并进行水浴声处理。随后用90%化OH 提取得到的材料并进行水浴声处理。在声处理后，随后对材料离屯、，并将得到的上清液注射 入HPLC(参见图5)。
[0319]实施例15.喷雾干燥方法
[0320] 通过W下进行喷雾干燥过程:将玉米醇溶蛋白和乳铁蛋白两者溶解在二元乙醇溶 液（即，55%化OH/巧樣酸盐缓冲液[CB])中，W使得抑为巧化且蛋白质的总浓度在1 10%w/v之间。在溶解之后，对溶液进行水浴声处理并在喷雾前进行可视化检查W确保完全 溶解。在喷雾干燥之前，Wl %的浓度从乙醇胆存溶液添加沙奎那韦并混合。利用化no Spray Dryer(B-90，BiiCHI)在室溫进行喷雾干燥，持续6-8小时。操作参数如下：
[0321] 通过4皿喷雾网喷雾干燥，喷雾率100%，入口溫度设定为100°C，且氮流速为15化/ min。
[0322] 使用合适的刮刀从收集筒收集干燥颗粒，并胆存在干燥器中直到使用。
[0323] 随后，可使用京尼平作为交联剂使化F纳米颗粒交联。在喷雾干燥之后，通过将纳 米颗粒分散体在包含京尼平（l.Omg/ml)的IOmM巧樣酸盐缓冲溶液中在室溫解育3到4小时 使ZLF纳米颗粒